IVF

Chasing Dreams

biosyntéza kyseliny Ibotenové v muchomůrce je iniciována hydroxylací glutamátu†

Amanita muscaria, moucha agarická, je možná nejvýznamnější ze všech hub, známá svým extravagantním vzhledem s červeným víčkem pokrytým bílými skvrnami a jeho neslavnou toxicitou. Zatímco houba je ve skutečnosti méně smrtící, než se obecně předpokládá, psychoaktivní účinky jsou zprostředkovány kyselinou ibotenovou (1) a jejím dekarboxylačním produktem muscimol (2).1-3 mají strukturní podobnost s neurotransmitery glutamátem (3) a GABA (4), resp. aktivují odpovídající receptory v mozku (Obrázek 1 A).4, 5 Vzhledem k jejich aktivitě byly 1 a 2 použity jako sloučeniny olova pro farmakologický výzkum; derivát kyseliny ibotenové AMPA například dal svůj název nejběžnějšímu glutamátovému receptoru v lidském mozku.6

obrázek
Obrázek 1

objev Ibo BGC. A) struktury metabolitů a analogů Amanita muscaria. B) schéma ibo BGC. C) GC-MS celkové iontové chromatogramy testů IboH: tvorba 3-hydroxyglutamátu byla závislá na 2-oxoglutarátu (2OG), enzymu a glutamátu. D) Stereoselektivní hydroxylace glutamátu IboH.

krátce po vyřešení struktury kyseliny ibotenové v roce 1964 se objevily spekulace o jejím biosyntetickém původu.1 na základě současně se vyskytujících metabolitů Eugster a spolupracovníci předpokládali, že kyselina ibotenová je odvozena od 3-hydroxyglutamátu (5).7 nicméně, 3-hydroxyglutamát nebyl identifikován v muchomůrce a biosyntéza kyseliny ibotenové a muscimolu zůstala nejasná.

k identifikaci biosyntetických genů jsme předpokládali, že tvorba kyseliny ibotenové je zahájena hydroxylací glutaminu nebo glutamátu. Dosud nebyl experimentálně ověřen žádný enzym, který katalyzuje tuto reakci na volném substrátu.8 přesto se 3-hydroxyglutamin (7, Obrázek 3) vyskytuje jako složka neribozomálního peptidu pneumocandinu B0 z Glarea lozoyensis. Jeho biosyntetický genový klastr (BGC) zahrnuje domnělou dioxygenázu, GloE, která byla navržena jako kandidátský enzym pro hydroxylaci glutaminu.9 proto jsme použili jeho proteinovou sekvenci k screeningu genomu a. muscaria.10 homologní protein IboH (GenBank entry KIL56739) je kódován v genetické oblasti, která obsahuje šest dalších biosyntetických enzymů. Tento domnělý ibo BGC (Obrázek 1 B) obsahuje enzym cytochromu P450 (IboC KIL56737), flavin‐dependentní monooxygenázu (FMO, IboF KIL56733), adenylační enzym (IboA KIL56732), dva vzájemně podobné enzymy závislé na pyridoxalfosfátu (PLP) (IboG1 KIL56738 a IboG2 KIL56740) a dekarboxylázu (IboD KIL56734). Geny zahrnují všechny funkce údajně potřebné pro biosyntézu kyseliny ibotenové (viz níže).

v důsledku toho bylo přiřazení BGC experimentálně ověřeno. Gen iboH byl exprimován v Escherichia coli s n-terminálním GST tagem (položka GenBank MN520442). Protože se předpokládá, že IboH je FeII/2‐oxoglutarát‐dependentní dioxygenáza, purifikovaný protein byl inkubován aerobně s Fe2+, 2-oxoglutarátem, kyselinou askorbovou a jedním z předpokládaných substrátů glutamin a glutamát. Reakční směsi byly derivatizovány ethylchloroformátem / ethanolem a analyzovány pomocí GC-MS. zatímco glutaminový test byl negativní, glutamát byl transformován na produkt, který byl detekován jako nový vrchol v chromatogramu GC-MS (Obrázek 1 C, 11,2 min). Kontrolní experimenty postrádající enzym, glutamát nebo 2-oxoglutarát nepřinesly produkt, což potvrzuje, že enzym je skutečně závislý na 2-oxoglutarátu.

vzhledem k tomu, že výtěžek purifikovaného enzymu byl příliš nízký pro izolaci produktu, byl použit celobuněčný přístup: inkubace živých buněk E. coli GST-iboH S L-glutamátem poskytla dostatečné množství produktu (podpůrné informace, Obrázek S1), který byl extrahován z buněčného supernatantu kationtově výměnnou chromatografií jako hydrochlorid. NMR analýza ukázala přítomnost threo-3-hydroxyglutamátu, což potvrdilo úlohu IboH jako L-glutamát 3‐(R) – hydroxylázy (Obrázky 1 D, S2 a S3).11 Toto je první zpráva o enzymatické hydroxylaci volného glutamátu.

pro stanovení biologického významu hydroxylace glutamátu v a. muscaria byly analyzovány vzorky hub (shromážděné poblíž Feldbergu, Černý les, Německo) pomocí GC-byla detekována kyselina Ibotenová spolu s nízkými hladinami 3-hydroxyglutamátu (obrázky S4 a S5). To naznačuje, že IboH je aktivní ve svém rodném organismu, což se shoduje s produkcí kyseliny ibotenové. Kromě toho veřejná data RNA-seq odhalila, že sedm genů v ibo BGC je vysoce exprimováno, když byl a. muscaria uměle pěstován v symbióze s Populusem, který se blíží jeho přirozenému stavu (Obrázek 2 A).12 aby se zjistilo, zda jsou geny funkčně propojeny, byla provedena analýza koexpresní sítě. Data ukázala, že Ibo geny mají velmi podobný vzorec exprese. Z celkem 11 915 exprimovaných genů se všech sedm Ibo genů těsně seskupilo, což naznačuje těsnou koregulaci a tím i společnou metabolickou funkci (Obrázek 2 B).13

obrázek
Obrázek 2

genomická a transkriptomická data ibo BGC. A) normalizovaná exprese Ibo genů přes datové sady RNA – seq od NCBI SRA: nízká exprese (Modrá) po vysokou expresi (červená). Černá čára označuje kokultivační experimenty Amanita muscaria s Populus tremula x tremuloides. Pro srovnání je zahrnut Gen β‐tubulinu. B) Lokálně nezávislé koexpresní shlukování 11 915 exprimovaných genů a.muscaria. Geny ibo se shlukují těsně vedle sebe, což naznačuje koregulaci. C) souběžný výskyt genů ibo a (domnělá) produkce kyseliny ibotenové u druhů Amanita se sekvenovanými genomy / transkriptomy. Tři druhy obsahující Ibo geny patří do sekce Amanita Amanita.

pro další zkoumání vazby ibo BGC na produkci kyseliny ibotenové byla transkriptomická data jiného producenta kyseliny ibotenové, Amanita pantherina, vyšetřena na homologní geny.14, 15 čtení RNA – seq byla mapována na ibo BGC. A. pantherina skutečně aktivně exprimuje blízké homology každého z Ibo genů (>80% nukleotidová identita, obrázek S6), což potvrzuje vazbu na produkci kyseliny ibotenové.

dále byl zkontrolován transkriptom příbuzných druhů hub Amanita crenulata na ibo homology. Opět všechny geny exprimovaly shody v A. crenulata (>80% identita nukleotidů, obrázek S7). Předpovídáme tedy, že tento druh je schopen produkovat kyselinu ibotenovou a muscimol. To koreluje s předchozími zprávami o intoxikaci člověka s příznaky, které se podobají příznakům po expozici kyselinou ibotenovou a muscimolem.16

dále jsme analyzovali genomy osmi druhů Amanita ze čtyř taxonomických sekcí, které neprodukují kyselinu ibotenovou. Žádný z nich neobsahuje ibo BGC, což dokládá korelaci mezi kyselinou ibotenovou a geny ibo (Obrázek 2 C). Zdá se, že přítomnost ibo BGC je omezena na sekci Amanita Amanita, což je v souladu s předchozími studiemi taxonomického rozdělení produkce kyseliny ibotenové.17, 18

k odvození biosyntetických funkcí proteinů ibo byly jejich sekvence porovnány se známými enzymy. Z toho navrhujeme funkce znázorněné na obrázku 3 a popsané v následujícím textu. Související proteiny se známými funkcemi jsou uvedeny v závorkách spolu s hodnotami identity aminokyselinové sekvence pro srovnání.

 obrázek
obrázek 3

navrhované alternativní biosyntetické dráhy kyseliny ibotenové. Cesta a zahrnuje N-hydroxylaci amidu 7 IboF. Cesta B zahrnuje N-hydroxylaci hypotetické vnější sloučeniny, která nekončí v konečné struktuře kyseliny ibotenové (1). Enzymy jsou označeny barevnými kruhy: naplněné pro ověřenou funkci, neplněné pro odvozenou funkci. PLP: pyridoxalfosfát-dependentní enzym; FMO: flavin-dependentní monooxygenáza.

prvním krokem je hydroxylace glutamátu IboH a posledním krokem je dekarboxylace kyseliny ibotenové na muscimol IboD (tryptofan dekarboxyláza P0DPA6, 20 32 %). Pořadí mezilehlých reakcí je poněkud nejednoznačné. IboA (adenylační doména F8P9P5,21 21 %) pravděpodobně aktivuje karboxylovou kyselinu v poloze 5 za účelem zavedení amidové vazby a flavin monooxygenáza IboF (heteroatom oxygenázy B8NM63, B8NM73, 22 21-24 %) vytváří n-o vazbu. Existuje několik možností pro druhý krok. Jednou z možností (Obrázek 3 A) je, že IboF přímo hydroxyluje amidový dusík tvořený IboA za vzniku druhu kyseliny hydroxamové (srov. biosyntéza trichostatinu23). Další možností (Obrázek 3 B) je, že IboF hydroxyluje vnější sloučeninu obsahující N, jejíž výsledná n-o vazba je následně zavedena do lešení hydroxyglutamátu (srov. cykloserinová biosyntéza24).

paralogní PLP-dependentní enzymy IboG1 a IboG2 (cystathionin γ-syntáza I1RZK8, 25 38-39 %) se pravděpodobně podílejí na substituci skupiny OH v poloze 3 O-N částí. Podobné substituční reakce jsou známy z jiných enzymů závislých na PLP, jako je cystathionin β-syntáza.26 alternativní cesta, která by mohla pokračovat bez IboG1 / IboG2, je uvedena v podpůrných informacích (obrázek S8).

prvním cyklickým meziproduktem je pravděpodobně kyselina tricholomová (6, Obrázek 1 A), která je pravděpodobně desaturována na kyselinu ibotenovou cytochromem P450 IboC (A1CFL5, A1CFL6, 27 A0A286LF02, 20 27-30 %). Kyselina tricholomová (6) je metabolit produkovaný tricholoma muscarium.28 vzhledem k tomu, že Tricholoma a Amanita jsou příbuzné (taxonomický řád Agaricales), biosyntéza 6 by měla být podobná biosyntéze kyseliny ibotenové, vynechání kroku desaturace. Byly navrženy další houby produkující kyselinu ibotenovou a kyselinu tricholomovou, od různých taxonů od druhů Amantia po Ustilago a Ophiocordyceps.17, 18, 29, 30 zde uvedená BGC nabízí příležitost přehodnotit navrhované producenty na genetické úrovni, a ověřit nebo vyvrátit hypotézu pro další producenty.

společně naše zjištění naznačují, že geny ibo jsou zodpovědné za produkci kyseliny ibotenové u—alespoň—tří druhů Amanita. Identifikovaný BGC obsahuje glutamáthydroxylázu IboH, jejíž aktivita byla prokázána v heterologním systému. Tento objev oživuje dlouho spící výzkum biosyntézy psychoaktivního toxinu v muchomůrce. Úplné objasnění biosyntetické dráhy odhalí reakce, které vedou k jádru isoxazolu, a umožní využití pro biotechnologické aplikace.

poděkování

Děkujeme Katharině Strackové a Saschovi Ferlainovi za technickou pomoc, PD Dr. Wolfgangu Hüttelovi za užitečné postřehy a komentáře, Dr. Jan-Patrick Steitz za houbový materiál a Dr. Kay Greenfield za kritické čtení rukopisu. Práce byla financována německou výzkumnou nadací (Deutsche Forschungsgemeinschaft -235777276).

střet zájmů

autoři nehlásí žádný střet zájmů.

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.