IVF

Chasing Dreams

Ibotensyre biosyntese i fluesvamp er initieret af Glutamathydroksylering kar

amanita muscaria, fluesvamp, er måske den mest fremtrædende af alle svampe, kendt for sit ekstravagante udseende med en rød hætte dækket af hvide pletter og dens berygtede toksicitet. Mens svampen faktisk er mindre dødelig end generelt antaget, medieres de psykoaktive virkninger af ibotensyre (1) og dets dekarboksyleringsprodukt muscimol (2).1-3 de har strukturel lighed med henholdsvis neurotransmitterne glutamat (3) og GABA (4), der aktiverer de tilsvarende receptorer i hjernen (Figur 1 a).4, 5 på grund af deres aktivitet er 1 og 2 blevet anvendt som blyforbindelser til farmakologisk forskning; ibotensyrederivatet AMPA har for eksempel givet sit navn til den mest almindelige glutamatreceptor i den menneskelige hjerne.6

billede
Figur 1

opdagelse af ibo BGC. A) strukturer af Amanita muscaria metabolitter og analoger. B) skematisk af ibo BGC. C) GC‐MS Total ionchromatogrammer af IboH‐analyser: 3-hydroksyglutamatdannelse var afhængig af 2-oksoglutarat (2og), glutamat og glutamat. D) Stereoselektiv glutamathydroksylering af IboH.

kort efter at strukturen af ibotensyre blev løst i 1964, var der spekulationer om dens biosyntetiske Oprindelse.1 baseret på samtidige metabolitter antog Eugster og kolleger, at ibotensyre er afledt af 3‐hydroksyglutamat (5).7 Imidlertid er 3-hydroksyglutamat ikke blevet identificeret i fluesvampen, og biosyntesen af ibotensyre og muscimol er forblevet uklar.

for at identificere de biosyntetiske gener antog vi, at dannelsen af ibotensyre initieres med hydroksylering af enten glutamin eller glutamat. Hidtil er der ikke eksperimentelt verificeret noget, der katalyserer denne reaktion på frit substrat.8 ikke desto mindre forekommer 3‐hydroksiglutamin (7, Figur 3) som en bestanddel af det ikke‐ribosomale peptid pneumocandin B0 fra Glarea passoyensis. En af de mest almindelige årsager til glutamin er, at glutamin er en af de mest almindelige typer af glutamin, der produceres af glutamin.9 derfor brugte vi dens proteinsekvens til at screene A. muscaria-genomet.10 faktisk er et homologt protein, IboH (GenBank entry KIL56739) kodet i en genetisk region, der indeholder seks yderligere biosyntetiske stoffer. Denne formodede ibo BGC (Figur 1 B) omfatter et cytokrom P450 (IboC KIL56737), en flavinafhængig monoksygenase (FMO, IboF KIL56733), et adenylerende (IboA KIL56732), to gensidigt ens pyridoksal phosphat (PLP)‐afhængige (IboG1 KIL56738 og IboG2 KIL56740) og en decarboksylase (IBOD Kil56734). Generne inkluderer alle funktionaliteter, der formodentlig er nødvendige til biosyntese af ibotensyre (se nedenfor).

derfor blev tildelingen af BGC verificeret eksperimentelt. IboH-genet blev udtrykt i Escherichia coli med en N‐terminal GST-tag (GenBank post MN520442). Da IboH forventes at være en FeII / 2‐oksoglutaratafhængig dioksygenase, blev det oprensede protein inkuberet aerobt med Fe2+, 2‐oksoglutarat, ascorbinsyre og et af de formodede substrater glutamin og glutamat. Reaktionsblandingerne blev derivatiseret med ethylchloroformat/ethanol og analyseret af GC‐MS. Mens glutaminanalysen var negativ, blev glutamat transformeret til et produkt, der blev påvist som en ny top i GC‐MS-kromatogrammet (Figur 1 C, 11,2 min). Kontroleksperimenter, der manglede enten glutamat, glutamat eller 2‐oksoglutarat, gav ikke produktet, hvilket bekræftede, at det faktisk er 2‐oksoglutaratafhængigt.

da udbyttet var for lavt til produktisolering, blev der anvendt en helcelletilgang: inkubation af levende E. coli GST‐iboH‐celler med l‐glutamat gav tilstrækkelige mængder af produktet (understøttende Information, figur S1), som blev ekstraheret fra cellesupernatanten ved kationbytningskromatografi som hydrochlorid. NMR-analyse viste tilstedeværelsen af threo-3‐hydroksiglutamat, hvilket bekræfter Ibohs rolle som et L‐glutamat 3‐(R) – hydroksylase (Figur 1 D, S2 og S3).11 Dette er den første rapport om hydroksylation af frit glutamat.

for at bestemme den biologiske relevans af glutamathydroksylering i A. muscaria blev svampeprøver (indsamlet nær Feldberg, Black Forest, Tyskland) analyseret af Gc‐Ms. Ibotensyre blev påvist sammen med lave niveauer af 3‐hydroksiglutamat (figurer S4 og S5). Dette antyder, at IboH er aktiv i sin oprindelige organisme, sammenfaldende med produktionen af ibotensyre. Desuden afslørede offentlige RNA‐sek-data, at de syv gener i ibo BGC er stærkt udtrykt, når A. muscaria kunstigt blev dyrket i symbiose med Populus, som er tæt på dets naturlige tilstand (figur 2 a).12 for at undersøge, om generne er funktionelt forbundet, blev coekspressionsnetværksanalyse udført. Dataene viste, at ibo-gener har et meget lignende ekspressionsmønster. Fra i alt 11 915 udtrykte gener grupperede alle syv ibo-gener tæt sammen, hvilket indikerer tæt koregulering og dermed en fælles metabolisk funktion (Figur 2 B).13

billede
figur 2

genomiske og transkriptomiske data for ibo BGC. A) normaliseret ekspression af ibo-gener på tværs af RNA-sekv-datasæt fra NCBI SRA: lav ekspression (blå) til høj ekspression (rød). Den sorte linje markerer kokultiveringseksperimenter af Amanita muscaria med Populus tremula h tremuloides. Karrus-tubulin-genet er inkluderet til sammenligning. B) Placeringsuafhængig coekspressionsklyngning af 11 915 udtrykte A. muscaria‐gener. Ibo-generne klynger sig tæt sammen, hvilket indikerer koregulering. C) samtidig forekomst af ibo‐generne og (formodet) ibotensyreproduktion af Amanita-arter med sekventerede genomer/transkriptomer. De tre arter, der indeholder ibo-gener, hører til Amanita-sektionen Amanita.

for yderligere at undersøge forbindelsen mellem ibo BGC og produktionen af ibotensyre blev transkriptomiske data fra en anden ibotensyreproducent, Amanita pantherina, screenet for homologe gener.14, 15 RNA‐sekv-aflæsningerne blev kortlagt til ibo BGC. Faktisk udtrykker A. pantherina aktivt tætte homologer af hvert af ibo-generne (>80% nukleotididentitet, figur S6), hvilket bekræfter forbindelsen til ibotensyreproduktion.

desuden blev transkriptomet af de beslægtede svampearter Amanita crenulata kontrolleret for ibo-homologer. Igen havde alle gener udtrykt kampe i A. crenulata (>80% nukleotididentitet, figur S7). Således forudsiger vi, at denne art er i stand til at producere ibotensyre og muscimol. Dette korrelerer med tidligere rapporter om human forgiftning med symptomer, der ligner dem efter ibotensyre og muscimol eksponering.16

derudover analyserede vi genomer af otte Amanita-arter fra fire taksonomiske sektioner, som ikke producerer ibotensyre. Ingen af disse indeholder ibo BGC, hvilket underbygger korrelationen mellem ibotensyre og ibo-generne (figur 2 C). Tilsyneladende er tilstedeværelsen af ibo BGC begrænset til Amanita-sektionen Amanita, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser af den taksonomiske fordeling af ibotensyreproduktion.17,18

for at udlede de biosyntetiske funktioner af ibo-proteinerne blev deres sekvenser matchet mod kendte. Ud fra dette foreslår vi de funktioner, der er illustreret i figur 3 og beskrevet i det følgende. Relaterede proteiner med kendte funktioner er angivet i parentes sammen med aminosyresekvensidentitetsværdier til sammenligning.

 billede
figur 3

foreslåede alternative biosyntetiske veje af ibotensyre. Vej a involverer N-hydroksylering af amidet af 7 af IboF. Vej B involverer n-hydroksylering af en hypotetisk ekstern forbindelse, som ikke ender i den endelige struktur af ibotensyre (1). Udfyldt for verificeret funktion, ikke-udfyldt for udledt funktion. FMO: flavinafhængig monooksygenase.

det første begåede trin er glutamathydroksylering af IboH,og det sidste trin er dekarboksylering19 af ibotensyre til muscimol af IboD (tryptophan decarboksylase P0DPA6, 20 32 %). Rækkefølgen af mellemreaktionerne er noget tvetydig. IboA (adenyleringsdomæne af F8P9P5,21 21 %) aktiverer sandsynligvis carboksyl−syren i position 5 for at indføre en amidbinding, og flavinmonoksygenasen IboF (heteroatom-iltaser B8NM63, B8NM73,22 21-24 %) genererer N-O-bindingen. Der er flere muligheder for sidstnævnte trin. En mulighed (figur 3 A) er, at IboF direkte hydroksylaterer amidnitrogen dannet af IboA til fremstilling af en hydroksaminsyreart (jf. trichostatin biosyntese23). En anden mulighed (figur 3 B) er, at IboF hydroksylater en ekstern n‐indeholdende forbindelse, hvis resulterende n−o-binding efterfølgende indføres i hydroksiglutamat stilladset (jf. cycloserin biosyntese24).

de paralogiske PLP‐afhængige IboG1 og IboG2 (cystathioninkrissyntase I1rsk8,25 38-39 %) er sandsynligvis involveret i substitution af OH‐gruppen i position 3 med O‐n-delen. Lignende substitutionsreaktioner er kendt fra andre PLP‐afhængige stoffer, såsom cystathioninrus‐syntase.26 en alternativ vej, der kunne fortsætte uden IboG1/IboG2, er angivet i den understøttende Information (figur S8).

det første cykliske mellemprodukt er sandsynligvis tricholomsyre (6, figur 1 A), som sandsynligvis er desatureret til ibotensyre af cytochrom P450 IboC (a1cfl5,a1cfl6,27 a0a286lf02, 20 27-30 %). Tricholomic acid (6) er en metabolit produceret af Tricholoma muscarium.28 Da Tricholom og Amanita er beslægtede (taksonomisk orden Agaricales), bør biosyntesen af 6 svare til den for ibotensyre, idet desatureringstrinnet udelades. Yderligere ibotensyre‐og tricholomic syre-producerende svampe er blevet foreslået, spænder forskellige taksa fra Amantia arter til Ustilago og Ophiocordyceps.17, 18, 29, 30 den her rapporterede BGC giver mulighed for at revurdere de foreslåede producenter på det genetiske niveau og således verificere eller tilbagevise hypotesen for yderligere producenter.

samlet set viser vores resultater, at ibo—generne er ansvarlige for ibotensyreproduktion i—mindst-tre Amanita-arter. Den identificerede BGC indeholder glutamathydroksylasen IboH, hvis aktivitet blev påvist i et heterologt system. Denne opdagelse genopliver den længe sovende forskning om psykoaktiv toksinbiosyntese i fly agaric. Fuld belysning af den biosyntetiske vej vil afsløre de reaktioner, der fører til isoksolkernen, og vil muliggøre udnyttelse til bioteknologiske anvendelser.

anerkendelser

vi takker Katharina Strack og Sascha Ferlaino for teknisk assistance, PD Dr. Dr. Kay Greenfield for kritisk læsning af manuskriptet. Arbejdet blev finansieret af det tyske Forskningsfond (Deutsche Forschungsgemeinschaft -235777276).

interessekonflikt

forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.