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Die Ibotensäure-Biosynthese im Fliegenpilz wird durch Glutamathydroxylierung initiiert†

Amanita muscaria, der Fliegenpilz, ist vielleicht der prominenteste aller Pilze, bekannt für sein extravagantes Aussehen mit einer roten Kappe, die von weißen Flecken bedeckt ist, und seine berüchtigte Toxizität. Während der Pilz tatsächlich weniger tödlich ist als allgemein angenommen, werden die psychoaktiven Wirkungen durch Ibotensäure (1) und sein Decarboxylierungsprodukt Muscimol (2) vermittelt.1-3 Sie besitzen strukturelle Ähnlichkeit mit den Neurotransmittern Glutamat (3) bzw. GABA (4) und aktivieren die entsprechenden Rezeptoren im Gehirn (Abbildung 1A).4, 5 Aufgrund ihrer Aktivität wurden 1 und 2 als Leitverbindungen für die pharmakologische Forschung verwendet; Das Ibotensäurederivat AMPA hat beispielsweise dem häufigsten Glutamatrezeptor im menschlichen Gehirn seinen Namen gegeben.6

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Abbildung 1

Entdeckung der ibo BGC. A) Strukturen von Amanita muscaria Metaboliten und Analoga. B) Schematische Darstellung des ibo BGC. C) GC-MS-Gesamtionenchromatogramme von IboH-Assays: Die Bildung von 3‐Hydroxyglutamat war abhängig von 2-Oxoglutarat (2OG), Enzym und Glutamat. D) Stereoselektive Glutamathydroxylierung durch IboH.

Kurz nachdem die Struktur der Ibotensäure 1964 geklärt war, gab es Spekulationen über ihren biosynthetischen Ursprung.1 Basierend auf gleichzeitig auftretenden Metaboliten stellten Eugster und Mitarbeiter die Hypothese auf, dass Ibotensäure von 3‐Hydroxyglutamat abgeleitet ist (5).7 3-Hydroxyglutamat wurde jedoch im Fliegenpilz nicht identifiziert, und die Biosynthese von Ibotensäure und Muscimol ist unklar geblieben.

Um die biosynthetischen Gene zu identifizieren, nahmen wir an, dass die Bildung von Ibotensäure mit der Hydroxylierung von Glutamin oder Glutamat initiiert wird. Bisher konnte kein Enzym, das diese Reaktion auf freiem Substrat katalysiert, experimentell nachgewiesen werden.8 Dennoch tritt 3‐Hydroxyglutamin (7, Abbildung 3) als Bestandteil des nicht‐ribosomalen Peptids Pneumocandin B0 aus Glarea lozoyensis auf. Sein biosynthetischer Gencluster (BGC) umfasst eine mutmaßliche Dioxygenase, GloE, die als Kandidatenenzym für die Hydroxylierung von Glutamin vorgeschlagen wurde.9 Daher haben wir seine Proteinsequenz verwendet, um das Genom von A. muscaria zu screenen.10 Tatsächlich ist ein homologes Protein, IboH (GenBank-Eintrag KIL56739), in einer genetischen Region kodiert, die sechs zusätzliche biosynthetische Enzyme enthält. Diese mutmaßliche IBO‐BGC (Abbildung 1B) umfasst ein Cytochrom‐P450-Enzym (IboC KIL56737), eine Flavin-abhängige Monooxygenase (FMO, IboF KIL56733), ein adenylierendes Enzym (IboA KIL56732), zwei einander ähnliche Pyridoxalphosphat (PLP) -abhängige Enzyme (IboG1 KIL56738 und IboG2 KIL56740) und eine Decarboxylase (IboD KIL56734). Die Gene enthalten alle Funktionen, die mutmaßlich für die Biosynthese von Ibotensäure benötigt werden (siehe unten).

Folglich wurde die Zuordnung des BGC experimentell verifiziert. Das iboH‐Gen wurde in Escherichia coli mit einem N-terminalen GST-Tag exprimiert (GenBank-Eintrag MN520442). Da es sich bei IboH um eine FeII/2‐Oxoglutarat‐abhängige Dioxygenase handelt, wurde das gereinigte Protein aerob mit Fe2+, 2‐Oxoglutarat, Ascorbinsäure und einem der mutmaßlichen Substrate Glutamin und Glutamat inkubiert. Die Reaktionsgemische wurden mit Chlorameisensäureethylester/Ethanol derivatisiert und mittels GC‐MS analysiert. Während der Glutamin‐Assay negativ war, wurde Glutamat in ein Produkt transformiert, das als neuer Peak im GC-MS-Chromatogramm nachgewiesen wurde (Abbildung 1C, 11,2 min). Kontrollexperimente, denen entweder Enzym, Glutamat oder 2‐Oxoglutarat fehlten, ergaben kein Produkt, was bestätigt, dass das Enzym tatsächlich 2‐Oxoglutarat‐abhängig ist.

Da die Ausbeute mit dem gereinigten Enzym für die Produktisolierung zu gering war, wurde ein Ganzzellansatz verwendet: Inkubation von lebenden E. coli GST‐iboH‐Zellen mit l‐Glutamat ergab ausreichende Mengen des Produkts (Unterstützende Information, Abbildung S1), das aus dem Zellüberstand durch Kationenaustauscherchromatographie als Hydrochlorid extrahiert wurde. Die NMR-Analyse zeigte das Vorhandensein von Threo-3-Hydroxyglutamat, was die Rolle von IboH als l‐Glutamat‐3‐ (R) -Hydroxylase bestätigt (Abbildungen 1D, S2 und S3).11 Dies ist der erste Bericht über eine enzymatische Hydroxylierung von freiem Glutamat.

Um die biologische Relevanz der Glutamathydroxylierung in A. muscaria zu bestimmen, wurden Pilzproben (gesammelt in der Nähe von Feldberg, Schwarzwald, Deutschland) mittels GC‐MS analysiert. Ibotensäure wurde zusammen mit geringen Mengen an 3‐Hydroxyglutamat nachgewiesen (Abbildungen S4 und S5). Dies deutet darauf hin, dass IboH in seinem nativen Organismus aktiv ist und mit der Produktion von Ibotensäure zusammenfällt. Darüber hinaus zeigten öffentliche RNA‐seq-Daten, dass die sieben Gene in der ibo BGC stark exprimiert werden, wenn A. muscaria künstlich in Symbiose mit Populus gezüchtet wurde, was seinem natürlichen Zustand nahe kommt (Abbildung 2A).12 Um zu untersuchen, ob die Gene funktionell verknüpft sind, wurde eine Koexpressionsnetzwerkanalyse durchgeführt. Die Daten zeigten, dass ibo-Gene ein sehr ähnliches Expressionsmuster aufweisen. Von insgesamt 11 915 exprimierten Genen gruppierten sich alle sieben ibo-Gene eng zusammen, was auf eine enge Koregulation und damit auf eine gemeinsame Stoffwechselfunktion hinweist (Abbildung 2B).13

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Abbildung 2

Genomische und transkriptomische Daten des ibo BGC. A) Normalisierte Expression von ibo-Genen über RNA-seq-Datensätze von NCBI SRA: niedrige Expression (blau) bis hohe Expression (rot). Die schwarze Linie markiert Kokultivierungsversuche von Amanita muscaria mit Populus tremula x tremuloides. Das β-Tubulin-Gen ist zum Vergleich enthalten. B) Ortsunabhängiges Coexpressionsclustering von 11 915 exprimierten A. muscaria-Genen. Die ibo-Gene gruppieren sich eng zusammen, was auf eine Koregulation hindeutet. C) Ko‐Vorkommen der ibo-Gene und (mutmaßliche) Ibotensäure-Produktion von Amanita-Spezies mit sequenzierten Genomen/Transkriptomen. Die drei Arten, die ibo-Gene enthalten, gehören zur Amanita-Sektion Amanita.

Um die Verbindung des ibo-BGC mit der Produktion von Ibotensäure weiter zu untersuchen, wurden transkriptomische Daten eines anderen Ibotensäureproduzenten, Amanita pantherina, auf homologe Gene untersucht.14, 15 Die RNA-seq-Lesevorgänge wurden auf die ibo-BGC abgebildet. Tatsächlich exprimiert A. pantherina aktiv enge Homologe jedes der ibo-Gene (> 80% Nukleotid-Identität, Abbildung S6), was die Verbindung zur Ibotensäure-Produktion bestätigt.

Des Weiteren wurde das Transkriptom der verwandten Pilzart Amanita crenulata auf ibo-Homologe überprüft. Wiederum hatten alle Gene Übereinstimmungen in A. crenulata exprimiert (> 80 % Nukleotididentität, Abbildung S7). Daher sagen wir voraus, dass diese Spezies Ibotensäure und Muscimol produzieren kann. Dies korreliert mit früheren Berichten über Vergiftungen beim Menschen mit Symptomen, die denen nach Ibotensäure- und Muscimol-Exposition ähneln.16

Zusätzlich analysierten wir die Genome von acht Amanita-Arten aus vier taxonomischen Sektionen, die keine Ibotensäure produzieren. Keines davon enthält die ibo-BGC, was die Korrelation zwischen Ibotensäure und den ibo-Genen belegt (Abbildung 2C). Anscheinend ist das Vorhandensein des Ibo-BGC auf Amanita-Abschnitt Amanita beschränkt, was früheren Studien zur taxonomischen Verteilung der Ibotensäureproduktion entspricht.17, 18

Um die biosynthetischen Funktionen der ibo-Proteine abzuleiten, wurden deren Sequenzen gegen bekannte Enzyme abgeglichen. Daraus schlagen wir die in Abbildung 3 dargestellten und im Folgenden beschriebenen Funktionen vor. Verwandte Proteine mit bekannten Funktionen sind in Klammern zusammen mit Aminosäuresequenzidentitätswerten zum Vergleich aufgeführt.

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Abbildung 3

Vorgeschlagene alternative Biosynthesewege von Ibotensäure. Weg A beinhaltet die N-Hydroxylierung des Amids von 7 durch IboF. Weg B beinhaltet die N-Hydroxylierung einer hypothetischen externen Verbindung, die nicht in der endgültigen Struktur von Ibotensäure endet (1). Enzyme werden durch farbige Kreise angezeigt: gefüllt für verifizierte Funktion, nicht gefüllt für abgeleitete Funktion. PLP: Pyridoxalphosphat-abhängiges Enzym; FMO: Flavin-abhängige Monooxygenase.

Der erste Schritt ist die Glutamathydroxylierung durch IboH, und der letzte Schritt ist die Decarboxylierung19 von Ibotensäure zu Muscimol durch IboD (Tryptophandecarboxylase P0DPA6, 20 32%). Die Reihenfolge der Zwischenreaktionen ist etwas mehrdeutig. IboA (Adenylierungsdomäne von F8P9P5,21 21%) aktiviert wahrscheinlich die Carbonsäure an Position 5, um eine Amidbindung einzuführen, und die Flavinmonooxygenase IboF (Heteroatomoxygenasen B8NM63, B8NM73,22 21-24%) erzeugt die N−O-Bindung. Für den letzteren Schritt gibt es mehrere Optionen. Eine Möglichkeit (Abbildung 3A) besteht darin, dass IboF den von IboA gebildeten Amidstickstoff direkt hydroxyliert, um eine Hydroxamsäurespezies zu erzeugen (vgl. trichostatin-Biosynthese23). Eine weitere Möglichkeit (Abbildung 3B) besteht darin, dass IboF eine externe N‐haltige Verbindung hydroxyliert, deren resultierende N−O-Bindung anschließend in das Hydroxyglutamatgerüst eingeführt wird (vgl. cycloserin-Biosynthese24).

Die paralogischen PLP‐abhängigen Enzyme IboG1 und IboG2 (Cystathionin γ‐Synthase I1RZK8,25 38-39 %) sind wahrscheinlich an der Substitution der OH‐Gruppe an Position 3 durch den O-N-Teil beteiligt. Ähnliche Substitutionsreaktionen sind von anderen PLP‐abhängigen Enzymen wie der Cystathionin‐β-Synthase bekannt.26 Ein alternativer Weg, der ohne IboG1/IboG2 verlaufen könnte, ist in den unterstützenden Informationen angegeben (Abbildung S8).

Das erste cyclische Zwischenprodukt ist höchstwahrscheinlich Tricholomsäure (6, Abbildung 1A), die wahrscheinlich durch das Cytochrom P450 IboC zu Ibotensäure desaturiert ist (A1CFL5, A1CFL6,27 A0A286LF02,20 27-30 %). Tricholomsäure (6) ist ein Metabolit, der von Tricholoma muscarium produziert wird.28 Da Tricholoma und Amanita verwandt sind (taxonomische Ordnung Agaricales), sollte die Biosynthese von 6 der von Ibotensäure ähnlich sein, wobei der Entsättigungsschritt weggelassen wird. Weitere Ibotensäure‐ und Tricholamsäure-produzierende Pilze wurden vorgeschlagen, die verschiedene Taxa von Amantia-Arten bis hin zu Ustilago und Ophiocordyceps umfassen.17, 18, 29, 30 Das hier berichtete BGC bietet die Möglichkeit, die vorgeschlagenen Produzenten auf genetischer Ebene neu zu bewerten und damit die Hypothese für weitere Produzenten zu verifizieren oder zu widerlegen.

Zusammengenommen deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die ibo—Gene für die Ibotensäure—Produktion in – mindestens – drei Amanita-Arten verantwortlich sind. Die identifizierte BGC enthält die Glutamathydroxylase IboH, deren Aktivität in einem heterologen System nachgewiesen wurde. Diese Entdeckung belebt die lange ruhende Forschung zur Biosynthese psychoaktiver Toxine im Fliegenpilz. Die vollständige Aufklärung des Biosyntheseweges wird die Reaktionen aufdecken, die zum Isoxazolkern führen, und die Nutzung für biotechnologische Anwendungen ermöglichen.

Danksagung

Wir danken Katharina Strack und Sascha Ferlaino für die technische Unterstützung, PD Dr. Wolfgang Hüttel für hilfreiche Einblicke und Kommentare, Dr. Jan-Patrick Steitz für das Material und Dr. Kay Greenfield für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (235777276) gefördert.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

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