IVF

Chasing Dreams

Ácido Iboténico en la Biosíntesis de matamoscas Es Iniciado por el Glutamato Hidroxilación†

Amanita muscaria, el matamoscas, es quizás la más destacada de todas las setas, conocido por su extravagancia, con una tapa de color rojo cubierto por manchas blancas, y su infame toxicidad. Si bien el hongo es en realidad menos mortal de lo que se supone generalmente, los efectos psicoactivos están mediados por el ácido iboténico (1) y su producto de descarboxilación muscimol (2).1-3 Poseen similitud estructural con los neurotransmisores glutamato (3) y GABA (4), respectivamente, activando los receptores correspondientes en el cerebro (Figura 1 A).4, 5 Debido a su actividad, 1 y 2 se han utilizado como compuestos de plomo para la investigación farmacológica; el derivado del ácido iboténico AMPA, por ejemplo, ha dado su nombre al receptor de glutamato más común en el cerebro humano.6

imagen
Figura 1

Descubrimiento del ibo BGC. A) Estructuras de metabolitos y análogos de Amanita muscaria. B) Esquema del ibo BGC. C) Cromatogramas iónicos totales GC‐MS de los ensayos de IboH: la formación de 3‐hidroxiglutamato dependía del 2‐oxoglutarato (2OG), la enzima y el glutamato. D) Hidroxilación estereoselectiva de glutamato por IboH.

Poco después de que se resolviera la estructura del ácido iboténico en 1964, se especuló sobre su origen biosintético.1 Basándose en metabolitos concurrentes, Eugster y sus compañeros de trabajo plantearon la hipótesis de que el ácido iboténico se deriva del 3‐hidroxiglutamato (5).7 Sin embargo, el 3‐hidroxiglutamato no se ha identificado en el agárico de moscas y la biosíntesis del ácido iboténico y el muscimol ha permanecido oscura.

Para identificar los genes biosintéticos, asumimos que la formación de ácido iboténico se inicia con la hidroxilación de glutamina o glutamato. Hasta ahora, no se ha verificado experimentalmente ninguna enzima que catalice esta reacción en sustrato libre.8 Sin embargo, la 3‐hidroxiglutamina (7, Figura 3) se presenta como un componente del péptido no ribosómico pneumocandina B0 de Glarea lozoyensis. Su grupo genético biosintético (BGC) incluye una supuesta dioxigenasa, la GloE, que se ha propuesto como una enzima candidata para la hidroxilación de la glutamina.9 Por lo tanto, utilizamos su secuencia de proteínas para analizar el genoma de A. muscaria.10 De hecho, una proteína homóloga, IboH (GenBank entry KIL56739), está codificada en una región genética que cuenta con seis enzimas biosintéticas adicionales. Este supuesto ibo BGC (Figura 1 B) comprende una enzima del citocromo P450 (IboC KIL56737), una monooxigenasa dependiente de flavina (FMO, iBoF KIL56733), una enzima adeniladora (IboA KIL56732), dos enzimas dependientes del fosfato de piridoxal (PLP) mutuamente similares (IboG1 KIL56738 e IboG2 KIL56740) y una descarboxilasa (IboD KIL56734). Los genes incluyen todas las funcionalidades supuestamente necesarias para la biosíntesis del ácido iboténico (ver más abajo).

En consecuencia, la asignación del CGB se verificó experimentalmente. El gen iboH se expresó en Escherichia coli con una etiqueta GST N-terminal (entrada GenBank MN520442). Como se predice que la IboH es una dioxigenasa dependiente de FeII / 2-oxoglutarato, la proteína purificada se incubó aeróbicamente con Fe2+, 2-oxoglutarato, ácido ascórbico y uno de los sustratos putativos glutamina y glutamato. Las mezclas de reacción se derivaron con cloroformato de etilo / etanol y se analizaron mediante GC-MS. Mientras que el ensayo de glutamina fue negativo, el glutamato se transformó en un producto que se detectó como un nuevo pico en el cromatograma GC‐MS (Figura 1 C, 11,2 min). Los experimentos de control que carecían de enzima, glutamato o 2‐oxoglutarato no produjeron el producto, confirmando así que la enzima es de hecho dependiente de 2‐oxoglutarato.

Como el rendimiento con la enzima purificada era demasiado bajo para el aislamiento del producto, se utilizó un enfoque de células enteras: la incubación de células vivas de E. coli GST‐iboH con l‐glutamato dio cantidades suficientes del producto (Información de apoyo, Figura S1), que se extrajo del sobrenadante celular mediante cromatografía de intercambio catiónico como clorhidrato. El análisis de RMN mostró la presencia de treo-3-hidroxiglutamato, confirmando el papel de la IboH como una l‐glutamato 3‐(R)‐hidroxilasa (Figuras 1 D, S2 y S3).11 Este es el primer informe de una hidroxilación enzimática de glutamato libre.

Para determinar la relevancia biológica de la hidroxilación de glutamato en A. muscaria, se analizaron muestras de hongos (colectadas cerca de Feldberg, Selva Negra, Alemania) mediante GC‐MS.Se detectó ácido iboténico junto con bajos niveles de 3‐hidroxiglutamato (Figuras S4 y S5). Esto sugiere que la IboH está activa en su organismo nativo, coincidiendo con la producción de ácido iboténico. Además, los datos públicos de ARN-seq revelaron que los siete genes en el ibo BGC están altamente expresados cuando A. muscaria se cultivó artificialmente en simbiosis con Populus, que está cerca de su condición natural (Figura 2 A).12 Para investigar si los genes están vinculados funcionalmente, se realizó un análisis de red de coexpresión. Los datos mostraron que los genes ibo tienen un patrón de expresión muy similar. De un total de 11 915 genes expresados, los siete genes ibo se agruparon muy juntos, lo que indica una corregulación estrecha y, por lo tanto, una función metabólica común (Figura 2 B).13

imagen
Figura 2

Datos genómicos y transcriptómicos del ibo BGC. A) Expresión normalizada de genes ibo a través de conjuntos de datos RNA‐seq desde NCBI SRA: baja expresión (azul) a alta expresión (rojo). La línea negra marca experimentos de cocultivo de Amanita muscaria con Populus tremula x tremuloides. El gen de la β‐tubulina se incluye para la comparación. B) Agrupamiento de coexpresión independiente de la ubicación de 11 915 genes A. muscaria expresados. Los genes ibo se agrupan muy juntos, lo que indica corregulación. C) Co‐ocurrencia de los genes ibo y producción (putativa) de ácido iboténico de especies Amanita con genomas/transcriptomas secuenciados. Las tres especies que contienen genes ibo pertenecen a la sección Amanita Amanita.

Para investigar más a fondo la relación del ibo BGC con la producción de ácido iboténico, se examinaron los datos transcriptómicos de otro productor de ácido iboténico, Amanita pantherina, en busca de genes homólogos.14, 15 Las lecturas de ARN‐seq se asignaron al ibo BGC. De hecho, A. pantherina expresa activamente homólogos cercanos de cada uno de los genes ibo (identidad de nucleótidos>80%, Figura S6), confirmando el vínculo con la producción de ácido iboténico.

Además, el transcriptoma de la especie de hongo relacionada Amanita crenulata se verificó en busca de homólogos ibo. Una vez más, todos los genes habían expresado coincidencias en A. crenulata (>80% de identidad de nucleótidos, Figura S7). Por lo tanto, podemos predecir que esta especie es capaz de producir ácido iboténico y muscimol. Esto se correlaciona con informes previos de intoxicación humana con síntomas que se asemejan a los de la exposición al ácido iboténico y al muscimol.16

Además, se analizaron genomas de ocho especies de Amanita de cuatro secciones taxonómicas, que no producen ácido iboténico. Ninguno de ellos contiene el ibo BGC, lo que corrobora la correlación entre el ácido iboténico y los genes ibo (Figura 2 C). Aparentemente, la presencia del ibo BGC se limita a la sección Amanita Amanita, lo que está de acuerdo con estudios previos sobre la distribución taxonómica de la producción de ácido iboténico.17, 18

Para deducir las funciones biosintéticas de las proteínas ibo, sus secuencias se compararon con enzimas conocidas. A partir de esto, proponemos las funciones ilustradas en la Figura 3 y descritas a continuación. Las proteínas relacionadas con funciones conocidas se enumeran entre paréntesis junto con los valores de identidad de la secuencia de aminoácidos para la comparación.

 imagen
Figura 3

Vías biosintéticas alternativas propuestas del ácido iboténico. La vía A implica la N-hidroxilación de la amida de 7 por iBoF. La vía B implica la N-hidroxilación de un compuesto externo hipotético que no termina en la estructura final del ácido iboténico (1). Las enzimas se indican mediante círculos de colores: rellenas para una función verificada, no rellenas para una función inferida. PLP: enzima dependiente del fosfato de piridoxal; FMO: monooxigenasa dependiente de flavina.

El primer paso comprometido es la hidroxilación de glutamato por IboH, y el último paso es la descarboxilación19 de ácido iboténico a muscimol por IboD(triptófano descarboxilasa P0DPA6, 20 32%). El orden de las reacciones intermedias es algo ambiguo. IboA (dominio de adenilación de F8P9P5,21 21 %) probablemente activa el ácido carboxílico en la posición 5 para introducir un enlace de amida, y la flavina monooxigenasa iBoF (oxigenasas heteroatomeas B8NM63, B8NM73,22 21-24 %) genera el enlace N−O. Hay varias opciones para este último paso. Una opción (Figura 3 A) es que iBoF hidroxila directamente el nitrógeno de amida formado por IboA para producir una especie de ácido hidroxámico (cf. biosíntesis de tricostatina 23). Otra opción (Figura 3 B) es que los hidroxilatos de iBoF son un compuesto externo que contiene N, cuyo enlace N‐O resultante se introduce posteriormente en el armazón de hidroxiglutamato (cf. biosíntesis de cicloserina 24).

Las enzimas paralógicas dependientes de PLP IboG1 e IboG2 (cistationina γ‐sintasa I1RZK8,25 38-39 %) están probablemente implicadas en la sustitución del grupo OH en la posición 3 por la fracción O‐N. Se conocen reacciones de sustitución similares a partir de otras enzimas dependientes de PLP, como la cistationina β‐sintasa.26 En la Información de apoyo (Figura S8) se indica una vía alternativa que podría seguir sin IboG1/IboG2.

El primer intermedio cíclico es probablemente el ácido tricolómico (6, Figura 1 A), que es probablemente desaturado a ácido iboténico por el citocromo P450 IboC (A1CFL5,A1CFL6,27 A0A286LF02, 20 27-30 %). El ácido tricolómico (6) es un metabolito producido por el Tricoloma muscarium.28 Como Tricholoma y Amanita están relacionados (orden taxonómico Agaricales), la biosíntesis de 6 debe ser similar a la del ácido iboténico, omitiendo el paso de desaturación. Se han propuesto otros hongos productores de ácido iboténico y ácido tricolómico, que abarcan diversos taxones, desde especies de Amantia hasta Ustilago y Ophiocordyceps.17, 18, 29, 30 La BGC reportada aquí ofrece la oportunidad de reevaluar a los productores propuestos a nivel genético, y así verificar o refutar la hipótesis para otros productores.

En conjunto, nuestros hallazgos indican que los genes ibo son responsables de la producción de ácido iboténico en al menos tres especies de Amanita. El GC identificado contiene la glutamato hidroxilasa IboH, cuya actividad se demostró en un sistema heterólogo. Este descubrimiento revive la investigación de largo tiempo inactiva sobre la biosíntesis de toxinas psicoactivas en el agárico de moscas. La dilucidación completa de la vía biosintética revelará las reacciones que conducen al núcleo de isoxazol y permitirá su utilización para aplicaciones biotecnológicas.

Agradecimientos

Agradecemos a Katharina Strack y Sascha Ferlaino por su asistencia técnica, al Dr. Wolfgang Hüttel por sus útiles ideas y comentarios, al Dr. Jan-Patrick Steitz para material fúngico, y la Dra. Kay Greenfield para leer críticamente el manuscrito. El trabajo fue financiado por la Fundación Alemana de Investigación (Deutsche Forschungsgemeinschaft -235777276).

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Deja una respuesta

Tu dirección de correo electrónico no será publicada.