IVF

Chasing Dreams

Iboteenihapon biosynteesi Kärpässienessä käynnistyy Glutamaattihydroksylaatiolla†

Amanita muscaria, kärpässienikärpänen, on ehkä huomattavin kaikista sienistä, joka tunnetaan loisteliaasta ulkonäöstään, jossa on valkoinen täplä, ja pahamaineisesta myrkyllisyydestään. Vaikka sieni on todellisuudessa vähemmän tappava kuin yleensä oletetaan, psykoaktiiviset vaikutukset välittyvät iboteenihaposta (1) ja sen dekarboksylaatiotuotteesta muskimolista (2).1-3 niillä on rakenteellinen samankaltaisuus aivojen vastaavia reseptoreita aktivoivien välittäjäaineiden glutamaatin (3) ja GABA: n (4) kanssa (kuva 1 A).4, 5 aktiivisuutensa vuoksi 1: tä ja 2: ta on käytetty lyijyyhdisteinä farmakologisessa tutkimuksessa; esimerkiksi iboteenihappojohdannainen AMPA on antanut nimensä yleisimmälle glutamaattireseptorille ihmisaivoissa.6

kuva
Kuva 1

Ibo BGC: n löytyminen. A) Amanita muscarian metaboliittien ja analogien rakenteet. B) Ibo BGC: n kaavamainen. C) GC‐MS iboh‐määritysten kokonaisionikromatogrammit: 3-hydroksiglutamaatin muodostuminen riippui 2-oksoglutaraatista (2OG), entsyymistä ja glutamaatista. D) Stereoselektiivinen glutamaattihydroksylaatio IboH: n vaikutuksesta.

pian sen jälkeen, kun iboteenihapon rakenne oli ratkaistu vuonna 1964, sen biosynteettisestä alkuperästä spekuloitiin.1 samanaikaisesti esiintyvien metaboliittien perusteella Eugster ja työtoverit olettivat, että iboteenihappo on peräisin 3‐hydroksiglutamaatista (5).7 3-hydroksiglutamaattia ei kuitenkaan ole tunnistettu kärpäsagaarissa ja iboteenihapon ja muskimolin biosynteesi on jäänyt hämäräksi.

biosynteettisten geenien tunnistamiseksi oletimme, että iboteenihapon muodostuminen aloitetaan joko glutamiinin tai glutamaatin hydroksylaatiolla. Tähän mennessä mitään entsyymiä, joka katalysoi tätä reaktiota vapaalla substraatilla, ei ole kokeellisesti varmennettu.8 kuitenkin 3‐hydroksiglutamiini (7, kuva 3) esiintyy glarea lozoyensiksen ei-ribosomaalisen peptidin pneumokandiini B0 komponenttina. Sen biosynteettiseen geeniklusteriin (BGC) kuuluu oletettu Dioksigenaasi GloE, jota on ehdotettu glutamiinin hydroksylaatioentsyymiksi.9 siksi käytimme sen proteiinisekvenssiä A. muscarian genomin seulomiseen.10 homologinen proteiini IboH (Genbankin merkintä KIL56739) on koodattu geneettiselle alueelle, jossa on kuusi muuta biosynteettistä entsyymiä. Tämä oletettu ibo BGC (Kuva 1 B) koostuu sytokromi P450‐entsyymistä (IboC KIL56737), flaviinista riippuvaisesta mono‐oksigenaasista (FMO, IboF KIL56733), adenyloivasta entsyymistä (IboA KIL56732), kahdesta keskenään samanlaisesta pyridoksaalifosfaatista (PLP) riippuvaisesta entsyymistä (IboG1 KIL56738 ja IboG2 KIL56740) ja dekarboksylaasista (IboD).kil56734). Geenit sisältävät kaikki toiminnot, joita iboteenihapon biosynteesissä tarvitaan (KS.alla).

näin ollen BGC: n osoittaminen todennettiin kokeellisesti. IboH-geeni ilmaistiin Escherichia coli‐bakteerissa N-terminaalisella GST-tunnisteella (GenBank-merkintä MN520442). Koska IboH: n ennustetaan olevan FeII/2‐oksoglutaraatista riippuvainen dioksigenaasi, puhdistettua proteiinia inkuboitiin aerobisesti Fe2+: lla, 2‐oksoglutaraatilla, askorbiinihapolla ja yhdellä oletetuista substraateista glutamiinilla ja glutamaatilla. Reaktioseokset johdettiin etyylikloroformaatilla / etanolilla ja analysoitiin GC‐MS: llä.glutamiinimäärityksen ollessa negatiivinen glutamaatti muunnettiin tuotteeksi, joka havaittiin uutena piikkinä GC‐MS-kromatogrammissa (Kuva 1 C, 11.2 min). Kontrollikokeet, joista puuttui joko entsyymi, glutamaatti tai 2‐oksoglutaraatti, eivät tuottaneet tuotetta, mikä vahvisti, että entsyymi on todellakin 2‐oksoglutaraatista riippuvainen.

koska saanto puhdistetulla entsyymillä oli liian alhainen tuotteen eristämiseen, käytettiin kokosolumenetelmää: elävien E. coli GST‐iboH‐solujen inkubointi l‐glutamaatilla antoi riittävän määrän tuotetta (tukitiedot, Kuva S1), joka uutettiin solun supernatantista kationinvaihtokromatografialla hydrokloridiksi. NMR‐analyysi osoitti Treo‐3‐hydroksiglutamaatin läsnäolon, mikä vahvisti IboH: n roolin l‐glutamaatti‐3 – (R) – hydroksylaasina (Kuvat 1 D, S2 ja S3).11 tämä on ensimmäinen raportti vapaan glutamaatin entsymaattisesta hydroksylaatiosta.

glutamaattihydroksylaation biologisen merkityksen määrittämiseksi A. muscariassa GC‐MS analysoi sieninäytteet (kerätty lähellä Feldbergiä, Schwarzwald, Saksa).Iboteenihapon ja alhaisten 3‐hydroksiglutamaattipitoisuuksien (kuvat S4 ja S5) avulla. Tämä viittaa siihen, että IboH on aktiivinen alkuperäisessä organismissaan samaan aikaan iboteenihapon tuotannon kanssa. Lisäksi julkiset RNA-seq-tiedot paljastivat, että ibo BGC: n seitsemän geeniä ilmentyvät voimakkaasti, kun A. muscaria kasvatettiin keinotekoisesti symbioosissa populuksen kanssa, joka on lähellä sen luonnollista tilaa (kuva 2 A).12 sen selvittämiseksi, ovatko geenit toiminnallisesti sidoksissa toisiinsa, tehtiin coexpression network-analyysi. Aineisto osoitti, että ibo-geeneillä on hyvin samankaltainen ilmentymämalli. Yhteensä 11 915 ilmentyneestä geenistä kaikki seitsemän ibo-geeniä ryhmittyivät tiiviisti yhteen, mikä viittaa tiiviiseen yhteissääntelyyn ja siten yhteiseen metaboliseen toimintaan (kuva 2 B).13

kuva
kuva 2

ibo BGC: n genomiset ja transkriptomiset tiedot. A) Ibo‐geenien normalisoitu ilmentyminen NCBI SRA: n RNA-seq-aineistoissa: low expression (sininen) to high expression (punainen). Musta viiva merkitsee Amanita muscarian kokultivaatiokokeita Populus tremula x tremuloides-rokotteella. Β-tubuliinigeeni on mukana vertailua varten. B) 11 915: n Paikkariippumaton koekspressioklusteraatio ilmaisi A. muscaria‐geenejä. Ibo-geenit ryhmittyvät tiiviisti yhteen, mikä viittaa yhteissääntelyyn. C) Amanita‐lajien ibo-geenien samanaikainen esiintyminen ja (oletettu) iboteenihapon tuotanto sekvensoiduilla genomeilla/transkriptomeilla. Ibo-geenejä sisältävät kolme lajia kuuluvat Amanita-sektioon Amanita.

jotta ibo BGC: n yhteyttä iboteenihapon tuotantoon voitaisiin tutkia tarkemmin, toisen iboteenihapon tuottajan, Amanita pantherinan, transkriptomitiedot seulottiin homologisten geenien varalta.14, 15 RNA‐seq: n lukemat kartoitettiin ibo BGC: hen. A. pantherina ilmaisee aktiivisesti kunkin ibo-geenin läheisiä homologeja (>80% nukleotididentiteetti, Kuva S6), mikä vahvistaa yhteyden iboteenihapon tuotantoon.

lisäksi lähisukulaisen sienilajin Amanita crenulatan transkriptomi tarkastettiin ibo-homologien varalta. Jälleen kaikki geenit olivat ilmaisseet vastaavuuksia A. crenulatassa (>80% nukleotidi-identiteetti, Kuva S7). Näin ollen ennustamme, että tämä laji pystyy tuottamaan iboteenihappoa ja muskimolia. Tämä korreloi aiempiin ilmoituksiin ihmisen myrkytyksestä oireilla, jotka muistuttavat iboteenihapolle ja muskimolille altistumisen jälkeisiä oireita.16

lisäksi analysoimme kahdeksan Amanita-lajin genomit neljästä taksonomisesta osasta, jotka eivät tuota iboteenihappoa. Mikään näistä ei sisällä iboteenihappoa (ibo BGC), mikä osoittaa iboteenihapon ja ibo-geenien välisen korrelaation (kuva 2 C). Ilmeisesti ibo BGC: n esiintyminen rajoittuu Amanita-sektioon Amanita, joka vastaa aiempia tutkimuksia iboteenihapon tuotannon taksonomisesta jakautumisesta.17, 18

ibo-proteiinien biosynteettisten toimintojen päättelemiseksi niiden sekvenssit täsmäsivät tunnettujen entsyymien kanssa. Tästä, ehdotamme tehtäviä kuvitettu kuva 3 ja kuvattu seuraavassa. Sukua olevat proteiinit, joilla on tunnetut funktiot, on lueteltu suluissa aminohapposekvenssin tunnistearvojen kanssa vertailua varten.

 kuva
kuva 3

iboteenihapon ehdotetut vaihtoehtoiset biosynteettiset reitit. Reittiin A liittyy 7: n amidin n-hydroksylaatio IboF: n avulla. Reittiin B liittyy hypoteettisen ulkoisen yhdisteen n-hydroksylaatio, joka ei päädy iboteenihapon lopulliseen rakenteeseen (1). Entsyymit on merkitty värillisillä ympyröillä: täytetty todennetulle funktiolle, ei täytetty päätellylle funktiolle. PLP: pyridoksaalifosfaatista riippuvainen entsyymi; FMO: flaviiniriippuvainen mono‐oksigenaasi.

ensimmäinen sitoutunut vaihe on glutamaattihydroksylaatio IboH: lla ja viimeinen vaihe on iboteenihapon dekarboksylaatio19 Muskimoliksi IboD: llä (tryptofaanidekarboksylaasi P0DPA6,20 32 %). Välireaktioiden järjestys on hieman epäselvä. IboA (f8p9p5: n adenylaatiodomeeni 21 21 %) todennäköisesti aktivoi karboksyylihapon asemassa 5 amidisidoksen aikaansaamiseksi,ja flaviinimonoksygenaasi IboF (heteroatomioksidaasit B8NM63, B8NM73, 22 21-24 %) tuottaa N−O-sidoksen. Jälkimmäiselle vaiheelle on useita vaihtoehtoja. Yksi vaihtoehto (Kuva 3 A) on, että IboF hydroksyloi suoraan IboA: n muodostaman amiditypen hydroksaamihappolajiksi (vrt. trikostatiinin biosynteesi23). Toinen vaihtoehto (Kuva 3 B) on, että IboF hydroksyloi ulkopuolisen N: ää sisältävän yhdisteen, jonka tuloksena syntyvä N‐O−sidos kulkeutuu myöhemmin hydroksiglutamaattitelineeseen (vrt. sykloseriinin biosynteesi24).

PARALOGISET PLP: stä riippuvaiset entsyymit IboG1 ja IboG2 (kystationiini‐γ‐syntaasi I1RZK8,25 38-39 %) osallistuvat todennäköisesti OH-ryhmän korvautumiseen kohdassa 3 O-N-osalla. Samanlaisia substituutioreaktioita tunnetaan muiltakin PLP-riippuvaisilta entsyymeiltä, kuten kystationiini‐β-syntaasilta.26 vaihtoehtoinen reitti, joka voisi edetä ilman IboG1/IboG2: ta, on esitetty asiaa tukevissa tiedoissa (Kuva S8).

ensimmäinen syklinen Välituote on mitä todennäköisimmin trikolomihappo (6, kuva 1 A), joka on sytokromi P450 IboC: n (A1CFL5,A1CFL6,27 A0A286LF02, 20 27-30%) tyydyttämä iboteenihapolle. Tricholomic acid (6) on tricholoma muscarium-organismin tuottama metaboliitti.28 koska Tricholoma ja Amanita ovat sukua keskenään (taksonominen lahko Agaricales), 6: n biosynteesin pitäisi olla samanlainen kuin iboteenihapolla, jättämättä pois desaturaatiovaihetta. Lisäksi on ehdotettu iboteenihappoa ja trikolomihappoa tuottavia sieniä, jotka vaihtelevat Amantia-lajeista Ustilago-ja Ophiocordyceps-lajeihin.17, 18, 29, 30 tässä selostettu BGC tarjoaa mahdollisuuden arvioida uudelleen ehdotettuja tuottajia geneettisellä tasolla ja siten tarkistaa tai kumota hypoteesi muiden tuottajien osalta.

yhdessä löydöksemme osoittavat, että ibo—geenit ovat vastuussa iboteenihapon tuotannosta ainakin kolmessa Amanita—lajissa. Tunnistettu BGC sisältää glutamaattihydroksylaasi IboH: ta, jonka aktiivisuus on osoitettu heterologisessa järjestelmässä. Tämä löytö herättää henkiin pitkään uinuneen tutkimuksen psykoaktiivisen toksiinin biosynteesistä kärpäsagaarissa. Biosynteettisen reitin täydellinen selvittäminen paljastaa reaktiot, jotka johtavat isoksatsoliytimeen, ja mahdollistaa bioteknologian sovellusten hyödyntämisen.

kiitokset

Kiitämme Katharina Strackia ja Sascha Ferlainoa teknisestä avusta, PD Dr. Wolfgang Hütteliä avuliaista oivalluksista ja kommenteista, Dr. Jan-Patrick Steitz sienimateriaalista ja tohtori Kay Greenfield käsikirjoituksen kriittisestä lukemisesta. Työtä rahoitti Saksalainen tutkimussäätiö (Deutsche Forschungsgemeinschaft -235777276).

eturistiriita

kirjoittajat ilmoittavat, ettei eturistiriitoja ole.

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.