IVF

Chasing Dreams

Iboténsav bioszintézisét a légyölő galóca által kezdeményezett glutamát hidroxilezés ~

Amanita muscaria, a légyölő galóca, talán a legkiemelkedőbb az összes gomba, ismert extravagáns megjelenése egy piros sapka borítja fehér foltok, és a hírhedt toxicitás. Bár a gomba valójában kevésbé halálos, mint általában feltételezik, a pszichoaktív hatásokat az iboténsav (1) és dekarboxilező terméke, a muszcimol (2) közvetíti.1-3 szerkezeti hasonlóságot mutatnak a glutamát (3) és a GABA (4) neurotranszmitterekkel, aktiválva a megfelelő receptorokat az agyban (1 A ábra).4, 5 aktivitásuk miatt az 1 és 2-et ólomvegyületként használták farmakológiai kutatásokhoz; az AMPA iboténsavszármazék például az emberi agy leggyakoribb glutamátreceptorának adta a nevét.6

kép
ábra 1

az ibo BGC felfedezése. A) az Amanita muscaria metabolitjainak és analógjainak szerkezete. B) az ibo BGC vázlata. C) GC‐MS iboh vizsgálatok összes ionkromatogramja: a 3‐hidroxi-glutamát képződése a 2-oxoglutaráttól (2OG), enzimtől és glutamáttól függ. D) Sztereoszelektív glutamát-hidroxilezés IboH-val.

röviddel azután, hogy az iboténsav szerkezetét 1964-ben megoldották, spekulációk merültek fel annak bioszintetikus eredetével kapcsolatban.1 az egyidejűleg előforduló metabolitok alapján Eugster és munkatársai feltételezték, hogy az iboténsav 3‐hidroxi-glutamátból származik (5).7 a légyölő galóca esetében azonban a 3‐hidroxiglutamátot nem azonosították, és az iboténsav és a muszcimol bioszintézise homályos maradt.

a bioszintetikus gének azonosításához feltételeztük, hogy az iboténsav képződése glutamin vagy glutamát hidroxilezésével kezdődik. Eddig kísérletileg nem igazoltak olyan enzimet, amely katalizálja ezt a reakciót a szabad szubsztráton.8 Mindazonáltal a 3‐hidroxi-glutamin (7, 3.ábra) a glarea lozoyensis-ből származó nem riboszomális peptid pneumocandin B0 komponenseként fordul elő. Bioszintetikus génklasztere (BGC) tartalmaz egy feltételezett dioxigenázt, A GloE-t, amelyet jelölt enzimként javasoltak a glutamin hidroxilezéséhez.9 ezért a fehérje szekvenciáját használtuk az A. muscaria Genom szűrésére.10 valójában egy homológ fehérje, az IboH (GenBank entry KIL56739) egy genetikai régióban van kódolva, amely hat további bioszintetikus enzimet tartalmaz. Ez a feltételezett ibo BGC (1 B ábra) tartalmaz egy citokróm P450 enzimet (IboC KIL56737), egy flavin‐függő monooxigenázt (FMO, IboF KIL56733), egy adenilező enzimet (IboA KIL56732), két kölcsönösen hasonló piridoxál‐foszfát (PLP) – függő enzimet (IboG1 KIL56738 és IboG2 KIL56740), valamint egy dekarboxilázt (IboD kil56734). A gének magukban foglalják az iboténsav bioszintéziséhez feltételezhetően szükséges összes funkciót (lásd alább).

következésképpen a BGC hozzárendelését kísérletileg igazoltuk. Az iboH gént Escherichia coli‐ban expresszáltuk N-terminális GST címkével (GenBank MN520442 bejegyzés). Mivel az IboH várhatóan FeII/2‐oxoglutarát‐függő dioxigenáz, a tisztított fehérjét aerob módon inkubáltuk Fe2+, 2‐oxoglutarát, aszkorbinsav, valamint az egyik feltételezett szubsztrát glutamin és glutamát. A reakcióelegyeket etil‐kloroformáttal/etanollal derivatizáltuk, és GC-MS-vel elemeztük. míg a glutamin teszt negatív volt, a glutamátot olyan termékké alakítottuk át, amelyet a GC‐MS kromatogramban új csúcsként detektáltunk (1 C ábra, 11,2 perc). Enzim, glutamát vagy 2‐oxoglutarát hiányában végzett kontroll kísérletek nem eredményezték a terméket, ezáltal megerősítve, hogy az enzim valóban 2‐oxoglutarát‐függő.

mivel a tisztított enzim hozama túl alacsony volt a termék izolálásához, egészsejtes megközelítést alkalmaztak: élő E. coli GST‐iboH sejtek l‐glutamáttal történő inkubálása elegendő mennyiségű terméket adott (alátámasztó információk, S1 ábra), amelyet a felülúszóból kationcserélő kromatográfiával hidrokloridként extraháltunk. Az NMR analízis kimutatta a Treo‐3‐hidroxi‐glutamát jelenlétét, megerősítve az IboH l‐glutamát‐3 – (R) – hidroxiláz szerepét (1.D, S2 és S3 ábra).11 Ez az első jelentés a szabad glutamát enzimatikus hidroxilezéséről.

az A. muscaria glutamát-hidroxilezésének biológiai relevanciájának meghatározásához a gombamintákat (Feldberg közelében, Fekete-erdő, Németország)GC‐MS-vel elemezték. Ez arra utal, hogy az IboH aktív a natív szervezetében, egybeesik az iboténsav termelésével. Ezenkívül a nyilvános RNS-seq adatok azt mutatták, hogy az ibo BGC hét génje erősen expresszálódik, amikor az A. muscaria mesterségesen szimbiózisban nőtt a Populusszal, amely közel áll a természetes állapotához (2 A ábra).12 annak vizsgálatára, hogy a gének funkcionálisan kapcsolódnak-e egymáshoz, koexpressziós hálózat elemzést végeztünk. Az adatok azt mutatták, hogy az ibo gének nagyon hasonló expressziós mintázattal rendelkeznek. Összesen 11 915 expresszált génből mind a hét ibo gén szorosan csoportosult, ami szoros koregulációt és így közös metabolikus funkciót jelez (2 B ábra).13

kép
ábra 2

az ibo BGC genomikai és transzkriptomikus adatai. A) az ibo gének normalizált expressziója az RNS-seq adatkészleteken keresztül az NCBI SRA – tól: alacsony expresszió (kék) a magas expresszióig (piros). A fekete vonal az Amanita muscaria Populus tremula x tremuloides-szal végzett kokultivációs kísérleteit jelöli. Összehasonlításképpen szerepel a .. – tubulin gén. B) 11 915 expressziós A. muscaria gének Helyfüggetlen koexpressziós csoportosítása. Az ibo gének szorosan összekapcsolódnak, jelezve a koregulációt. C) az ibo gének együttes előfordulása és az Amanita Fajok (feltételezett) iboténsavtermelése szekvenált genomokkal/transzkriptómákkal. Az ibo géneket tartalmazó három faj az Amanita szakaszba tartozik.

az ibo BGC kapcsolatának további vizsgálata az iboténsav termelésével, egy másik iboténsav-termelő transzkriptomikus adatait, Amanita pantherina, homológ génekre szűrtük.14, 15 az RNS‐seq leolvasásokat leképeztük az ibo BGC-re. Valójában az A. pantherina aktívan fejezi ki az egyes ibo gének közeli homológjait (>80% nukleotid-identitás, S6 ábra), megerősítve az iboténsavtermeléshez való kapcsolatot.

ezenkívül az Amanita crenulata rokon gombafajok transzkriptomját ellenőrizték ibo homológok szempontjából. Ismét az összes gén kifejezte az egyezéseket az A. crenulata – ban (>80% nukleotid identitás, S7 ábra). Így azt jósoljuk, hogy ez a faj képes iboténsav és muszcimol előállítására. Ez korrelál az iboténsav-és muszcimol-expozíciót követő tünetekhez hasonló humán intoxikációról szóló korábbi jelentésekkel.16

ezenkívül négy taxonómiai szakaszból nyolc Amanita faj genomját elemeztük, amelyek nem termelnek iboténsavat. Ezek egyike sem tartalmazza az ibo BGC-t, ami alátámasztja az iboténsav és az ibo gének közötti összefüggést (2 C ábra). Nyilvánvaló, hogy az ibo BGC jelenléte az Amanita szakaszra korlátozódik, amely összhangban van az iboténsavtermelés taxonómiai eloszlásával kapcsolatos korábbi tanulmányokkal.17, 18

az ibo fehérjék bioszintetikus funkcióinak levezetéséhez szekvenciáikat az ismert enzimekkel illesztettük össze. Ebből javasoljuk a 3. ábrán bemutatott és az alábbiakban ismertetett funkciókat. Az ismert funkciókkal rendelkező kapcsolódó fehérjéket zárójelben soroljuk fel az aminosav-szekvencia azonossági értékekkel együtt összehasonlítás céljából.

 kép
ábra 3

javasolt alternatív bioszintetikus utak iboténsav. Az a út magában foglalja a 7 amidjának N-hidroxilezését IboF által. A B út magában foglalja egy hipotetikus külső vegyület n‐hidroxilezését, amely nem kerül az iboténsav végső szerkezetébe (1). Az enzimeket színes körök jelzik: töltött az ellenőrzött funkcióhoz, nem töltött a következtetett funkcióhoz. PLP: piridoxál-foszfát-függő enzim; FMO: flavin-függő monooxigenáz.

az első elkötelezett lépés a glutamát hidroxilezése IboH-val,az utolsó lépés pedig az iboténsav dekarboxilezése19 muszcimol IboD által (triptofán dekarboxiláz P0DPA6, 20 32 %). A közbenső reakciók sorrendje kissé kétértelmű. Az IboA (az F8P9P5,21 21% adenilációs doménje) valószínűleg aktiválja a karbonsavat az 5.pozícióban, hogy amidkötést vezessen be, és az IboF flavin monooxigenáz (heteroatom oxigenázok B8NM63,B8NM73, 22 21-24 %) generálja az N−O kötést. Az utóbbi lépésnek számos lehetősége van. Az egyik lehetőség (3a.ábra) az, hogy az IboF közvetlenül hidroxilálja az iboa által képződött amid-nitrogént, hogy hidroxámsav-fajokat állítson elő (vö. trichostatin bioszintézis23). Egy másik lehetőség (3 B ábra)az, hogy az IboF hidroxilál egy külső N-tartalmú vegyületet, amelynek az így létrejövő N – o kötést ezután a hidroxiglutamát állványba vezetjük (vö. cikloszerin bioszintézis24).

a paralogos PLP‐függő ibog1 és IboG2 enzimek (cisztationin 6‐szintáz I1RZK8,25 38-39 %) valószínűleg részt vesznek a 3.pozícióban lévő OH csoport O‐N résszel való helyettesítésében. Hasonló szubsztitúciós reakciók ismertek más PLP-függő enzimekből,mint például a cisztationin-ons-szintáz.26 egy alternatív útvonal, amely ibog1/IboG2 nélkül is folytatódhat, az alátámasztó információban található (S8 ábra).

az első ciklikus intermedier valószínűleg a tricholomsav (6, 1.ábra A), amelyet a citokróm P450 IboC valószínűleg iboténsavvá deszaturál (A1CFL5, A1CFL6,27 a0a286lf02,20 27-30%). A tricholomsav (6) a tricholoma muscarium által termelt metabolit.28 mivel a Tricholoma és az Amanita rokon (Agaricales rendszertani rend), a 6 bioszintézisének hasonlónak kell lennie az iboténsavéhoz, kihagyva a deszaturációs lépést. További iboténsav‐ és tricholomsav‐termelő gombákat javasoltak, különböző taxonokat az Amantia fajoktól az Ustilago és az Ophiocordycepsig.17, 18, 29, 30 az itt közölt BGC lehetőséget kínál a javasolt termelők genetikai szinten történő újraértékelésére, ezáltal a hipotézis további termelők számára történő igazolására vagy megcáfolására.

eredményeink együttesen azt mutatják, hogy az ibo gének felelősek legalább három Amanita faj iboténsavtermeléséért. Az azonosított BGC tartalmazza az iboh glutamát-hidroxilázt, amelynek aktivitását heterológ rendszerben mutatták ki. Ez a felfedezés feleleveníti a légyölő galóca pszichoaktív toxin bioszintézisének régóta szunnyadó kutatását. A bioszintetikus út teljes tisztázása feltárja az izoxazol maghoz vezető reakciókat, és lehetővé teszi a biotechnológiai alkalmazásokhoz való felhasználást.

Köszönetnyilvánítás

köszönjük Katharina Stracknek és Sascha Ferlaino-nak a technikai segítséget, Dr. Wolfgang H. Jan-Patrick Steitz a gombás anyagért, Dr. Kay Greenfield pedig a kézirat kritikus olvasásáért. A munkát a Német Kutatási Alapítvány (Deutsche Forschungsgemeinschaft -235777276) finanszírozta.

összeférhetetlenség

a szerzők nem nyilatkoznak összeférhetetlenségről.

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.