IVF

Chasing Dreams

アガリクスのイボテン酸生合成はグルタミン酸ヒドロキシル化によって開始されるΓ

アガリクスのアマニタムスカリアは、おそらくすべてのキノコの中で最も顕著であり、白い斑点で覆われた赤い帽子とその悪名高い毒性で知られている。 キノコは実際には一般的に想定されるよりも致命的ではありませんが、精神活性効果はイボテン酸(1)とその脱炭酸生成物ムシモール(2)によって媒介さ1-3それらは、それぞれ神経伝達物質グルタミン酸(3)およびGABA(4)と構造的類似性を有し、脳内の対応する受容体を活性化する(図1A)。4、5それらの活性のために、1および2は薬理学的研究のための鉛化合物として使用されてきた;例えば、イボテン酸誘導体AMPAは、ヒトの脳内で最も一般的なグルタミン酸受容体にその名を与えている。6

画像
1

ibo BGCの発見。 A)Amanita muscaria代謝産物および類似体の構造。 B)ibo BGCの回路図。 C)Gc‐MS IboHアッセイの総イオンクロマトグラム:3‐ヒドロキシグルタミン酸形成は、2-オキソグルタル酸(2OG)、酵素、およびグルタミン酸に依存していた。 D)Ibohによる立体選択的グルタミン酸ヒドロキシル化。

イボテン酸の構造が1964年に解明された直後に、その生合成起源に関する憶測があった。共同発生する代謝産物に基づいて、Eugsterと共同研究者は、イボテン酸が3‐ヒドロキシグルタミン酸に由来すると仮定した(5)。7しかし、3-ヒドロキシグルタミン酸は、フライ寒天で同定されておらず、イボテン酸とムシモールの生合成は不明のままである。

生合成遺伝子を同定するために、イボテン酸の形成はグルタミンまたはグルタミン酸のいずれかのヒドロキシル化で開始されると仮定した。 これまで、遊離基質上でこの反応を触媒する酵素は実験的に検証されていない。それにもかかわらず、3‐ヒドロキシグルタミン(図7、図3)は、Glarea lozoyensisからの非リボソームペプチドpneumocandin B0の成分として生じる。 その生合成遺伝子クラスター(BGC)には,グルタミンのヒドロキシル化の候補酵素として提案されている推定ジオキシゲナーゼGloeが含まれている。9そのため、我々はA.muscariaゲノムをスクリーニングするためにそのタンパク質配列を使用しました。実際、相同タンパク質であるIboh(Genbank entry KIL5 6 7 3 9)は、6つの追加の生合成酵素を特徴とする遺伝的領域にコードされている。 この推定ibo BGC(図1B)は、シトクロムP450酵素(IboC KIL56737)、フラビン依存性モノオキシゲナーゼ(FMO、IboF KIL56733)、アデニル化酵素(IboA KIL56732)、二つの相互に類似したピリドキサールリン酸(PLP)依存性酵素(Ibog1KIL56738およびIbog2KIL56740)、およびデカルボキシラーゼ(IboD Kil56740)を含む。kil56734)。 この遺伝子には、イボテン酸の生合成に必要とされるすべての機能性が含まれる(下記参照)。

その結果、BGCの割り当てが実験的に検証されました。 IBOH遺伝子は、N末端GSTタグ(Genbank entrytry MN5 2 0 4 4 2)を用いて大腸菌で発現させた。 IboHはFeII/2‐オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼであると予測されるように、精製されたタンパク質はFe2+、2‐オキソグルタル酸、アスコルビン酸、および推定基質グルタミンとグルタミン酸の一つと好気的にインキュベートされた。 反応混合物をクロロギ酸エチル/エタノールで誘導体化し、GC‐MSによって分析した。 酵素、グルタミン酸、または2‐オキソグルタル酸のいずれかを欠いている対照実験は、このように酵素が実際に2‐オキソグルタル酸依存性であることを確認し、生成物を得られませんでした。

精製酵素による収率が製品単離には低すぎるため、生大腸菌GST‐iboH細胞をl‐グルタミン酸でインキュベーションすると、十分な量の製品が得られ(支持情報、図S1)、細胞上清から塩酸塩として陽イオン交換クロマトグラフィーによって抽出された。 NMR分析は、スレオ‐3‐ヒドロキシグルタミン酸の存在を示し、L‐グルタミン酸3‐(R)‐ヒドロキシラーゼであるとしてIboHの役割を確認した(図1D、S2、およびS3)。11これは遊離グルタミン酸の酵素的ヒドロキシル化の最初の報告である。

a.muscariaにおけるグルタミン酸ヒドロキシル化の生物学的関連性を決定するために、キノコのサンプル(Feldberg、Black Forest、Germanyの近くで収集)をGC‐MSによって分析した。 これは、イボテン酸の生産と一致して、そのネイティブの生物で活性であるIboHに向かってヒントします。 さらに、公のRNA-seqデータから、a.muscariaを自然条件に近いポプラと共生して人工的に成長させると、ibo BGCの7つの遺伝子が高発現することが明らかになりました(図2A)。12遺伝子が機能的にリンクされているかどうかを調べるために、共発現ネットワーク解析を行った。 データは、ibo遺伝子が非常に類似した発現パターンを有することを示した。 合計11個の915個の発現遺伝子から、7個のibo遺伝子すべてが密接にクラスタ化され、緊密な共調節、したがって共通の代謝機能を示しています(図2B)。13

画像
フィギュア2

ibo BGCのゲノムおよびトランスクリプトミックデータ。 A)NCBI SRAからのRNA−seqデータセットにわたるibo遺伝子の正規化された発現:低発現(青色)から高発現(赤色)。 黒い線は、Populus tremula x tremuloidesとAmanita muscariaの共培養実験を示しています。 比較のためにβ‐チューブリン遺伝子を含めた。 B)11 915の場所に依存しない共発現クラスタリングは、A.muscaria遺伝子を発現しました。 Ibo遺伝子は密接に一緒にクラスターし、coregulationを示しています。 C)配列されたゲノム/トランスクリプトームとのibo遺伝子の共発生および(推定)Ibotenic酸の生産Amanita種。 Ibo遺伝子を含む三つの種はAmanitaセクションAmanitaに属しています。

さらにibo BGCのイボテン酸の生産へのリンクをプローブするために、別のイボテン酸生産者、Amanita pantherinaの転写データは、相同遺伝子のためにスクリーニングされました。RNA−seqの読み取りをibo BGCにマッピングした。 実際、a.pantherinaは、それぞれのibo遺伝子の密接な同族体を積極的に発現し(>80%ヌクレオチド同一性、図S6)、イボテン酸産生との関連を確認している。

さらに、関連するキノコ種Amanita crenulataのトランスクリプトームについてiboホモログをチェックしました。 再び、全ての遺伝子は、A.crenulataにおいて一致を発現していた(<7 2 2 1>8 0%ヌクレオチド同一性、図S7)。 この種はイボテン酸とムシモールを産生することができると予測した。 これは、イボテン酸およびムシモール曝露後の症状に似た症状を伴うヒト中毒の以前の報告と相関する。16

さらに、イボテン酸を産生しない四つの分類学的セクションから八アマニタ種のゲノムを分析しました。 これらのいずれもibo BGCを含まず、iboten酸とibo遺伝子との間の相関を実証している(図2C)。 明らかに、ibo BGCの存在は、iboten酸産生の分類学的分布に関する以前の研究に従ったAmanitaセクションAmanitaに限定されています。17,18

iboタンパク質の生合成機能を推定するために、それらの配列を既知の酵素と照合した。 このことから、図3に示す機能を提案し、以下で説明します。 既知の機能を有する関連タンパク質は、比較のためにアミノ酸配列同一性値とともに括弧内に記載されている。

画像
図3

イボテン酸の代替生合成経路を提案した。 経路Aは、Ibofによる7のアミドのN−ヒドロキシル化を含む。 経路Bは、イボテン酸(1)の最終構造に終わらない仮説的な外部化合物のN‐ヒドロキシル化を伴う。 酵素は着色された円によって示されます:確認された機能のために満たされて、推論された機能のために非満たされて。 PLP:ピリドキサールリン酸依存性酵素;FMO:フラビン依存性モノオキシゲナーゼ。

最初のコミットされたステップはIboHによるグルタミン酸ヒドロキシル化であり、最後のステップはIboDによるイボテン酸のムシモールへの脱炭酸19である(トリプトファン脱炭酸酵素P0DPA6,20 32%)。 中間反応の順序はややあいまいである。 IboA(f8P9P5のアデニル化ドメイン,21 21%)は5位のカルボン酸を活性化してアミド結合を導入し、フラビンモノオキシゲナーゼIboF(ヘテロ原子オキシゲナーゼB8NM63,B8NM73,22 21−24%)はN-O結合を生成する。 後者のステップにはいくつかのオプションがあります。 一つの選択肢(図3A)は、IboFがIboAによって形成されたアミド窒素を直接ヒドロキシル化してヒドロキサム酸種を生成することである(cf. トリコスタチン生合成23)。 別の選択肢(図3B)は、IboFが外部のN‐含有化合物をヒドロキシル化し、その結果生じるN−O結合が続いてヒドロキシグルタミン酸足場に導入されることである(cf. シクロセリン生合成24)。

パラログPLP依存性酵素Ibog1とIbog2(シスタチオニンγ‐シンターゼI1RZK8,25 38‐39%)は、O‐N部分による位置3のOH基の置換に関与している可能性が高い。 同様の置換反応は、シスタチオニンβ‐シンターゼのような他のPLP依存性酵素から知られている。支持情報には、Ibog1/Ibog2なしで進行することができる代替経路が示されている(図S8)。

最初の環状中間体はおそらくトリコロム酸であり(図6、図1A)、シトクロムP450IboC(A1CFL5、A1CFL6、27A0A286LF02、20 27-30%)によってイボテン酸に不飽和化されている可能性が高い。 トリコローム酸(Tricholomic acid)(6)は、トリコローム-ムスカリウムによって産生される代謝産物である。28TricholomaとAmanitaが関連しているので(分類学的にはAgaricales)、6の生合成はイボテン酸の生合成と同様であり、不飽和化ステップを省略する必要があります。 さらにイボテン酸およびトリコローム酸産生菌が提案されており、アマンティア種からウスティラゴおよびオフィオコルディセプスに至る多様な分類群が提案されている。17、18、29、30ここで報告されたBGCは、遺伝子レベルで提案された生産者を再評価し、したがって、さらなる生産者のための仮説を検証または反論する機会を提

まとめると、私たちの発見は、ibo遺伝子が少なくとも3種のアマニタ種でイボテン酸産生に関与していることを示しています。 同定されたBGCにはグルタミン酸ヒドロキシラーゼIbohが含まれており,その活性は異種系で実証された。 この発見は、ハエのアガリクスにおける精神活性毒素生合成に関する長年の休眠研究を復活させる。 生合成経路の完全な解明は、イソオキサゾールコアにつながる反応を明らかにし、バイオテクノロジーへの応用のための利用を可能にするであろう。

謝辞

私たちは、技術支援のためのKatharina StrackとSascha Ferlaino、有用な洞察とコメントのためのWolfgang Hüttel PD博士に感謝します。 真菌材料のためのJan‐Patrick Steitz、および批判的に原稿を読むためのDr.Kay Greenfield。 この研究は、ドイツ研究財団(Deutsche Forschungsgemeinschaft-235777276)によって資金提供されました。

利益相反

著者は利益相反を宣言していません。

コメントを残す

メールアドレスが公開されることはありません。