IVF

Chasing Dreams

biosynthese van Iboteenzuur in de vlieg agaric wordt geïnitieerd door glutamaat hydroxylatie†

Amanita muscaria, de vlieg agaric, is misschien wel de meest prominente van alle paddenstoelen, bekend om zijn extravagante verschijning met een rode dop bedekt met witte vlekken, en zijn beruchte toxiciteit. Hoewel de paddenstoel eigenlijk minder dodelijk is dan algemeen wordt aangenomen, worden de psychoactieve effecten gemedieerd door iboteenzuur (1) en zijn decarboxylatieproduct muscimol (2).1-3 zij bezitten structurele gelijkenis met de neurotransmitters glutamaat (3) en GABA (4), respectievelijk, die de overeenkomstige receptoren in de hersenen activeren (figuur 1 A).4, 5 wegens hun activiteit, zijn 1 en 2 gebruikt als loodsamenstellingen voor farmacologisch onderzoek; het ibotenic zuurderivaat AMPA, bijvoorbeeld, heeft zijn naam aan de gemeenschappelijkste glutamaatreceptor in de menselijke hersenen gegeven.6

afbeelding
figuur 1

ontdekking van de IBO BGC. A) structuren van Amanita muscaria metabolieten en analogen. B) schema van de IBO BGC. C) GC‐MS totale ionchromatogrammen van iboh‐analyses: de vorming van 3-hydroxyglutamaat was afhankelijk van 2-oxoglutaraat (2OG), enzym, en glutamaat. D) Stereoselectieve glutamaathydroxylatie door IboH.

kort nadat de structuur van ibotenic zuur in 1964 werd opgelost, was er speculatie over zijn biosynthetische oorsprong.1 op basis van co‐voorkomende metabolieten veronderstelden Eugster en collega ‘ s dat iboteenzuur is afgeleid van 3‐hydroxyglutamaat (5).7 3-hydroxyglutamaat is echter niet geïdentificeerd in de vliegagarische en de biosynthese van iboteenzuur en muscimol is onduidelijk gebleven.

om de biosynthetische genen te identificeren, gingen we ervan uit dat de vorming van iboteenzuur wordt geïnitieerd door de hydroxylering van ofwel glutamine ofwel glutamaat. Tot nu toe is geen enzym dat deze reactie op vrij substraat katalyseert experimenteel geverifieerd.8 niettemin komt 3‐hydroxyglutamine (7, figuur 3) voor als bestanddeel van het niet‐ribosomale peptide pneumocandine B0 uit Glarea lozoyensis. Zijn biosynthetische gencluster (BGC) omvat een vermeende dioxygenase, GloE, die als kandidaatenzym voor de hydroxylatie van glutamine is voorgesteld.9 daarom gebruikten we de eiwitsequentie om het A. muscaria-genoom te screenen.10 inderdaad, een homoloog eiwit, IboH (GenBank entry KIL56739), is gecodeerd in een genetisch gebied dat beschikt over zes extra biosynthetische enzymen. Deze vermeende ibo BGC (Figuur 1 B) bestaat uit een cytochroom P450-enzym (IboC KIL56737), een flavin‐afhankelijke monooxygenase (FMO, IboF KIL56733), een adenylating enzym (IboA KIL56732), twee onderling vergelijkbare pyridoxaal-fosfaat (PLP)‐afhankelijke enzymen (IboG1 KIL56738 en IboG2 KIL56740), en een decarboxylase (IboD KIL56734). De genen bevatten alle functionaliteiten die vermoedelijk nodig zijn voor de biosynthese van iboteenzuur (zie hieronder).

Bijgevolg werd de toewijzing van de BGC experimenteel geverifieerd. Het iboh-gen werd uitgedrukt in Escherichia coli met een n-terminale GST-tag (GenBank entry MN520442). Aangezien IboH wordt voorspeld als een FeII / 2-oxoglutaraat-afhankelijke dioxygenase, werd het gezuiverde eiwit aerobisch geïncubeerd met Fe2+, 2‐oxoglutaraat, ascorbinezuur en een van de veronderstelde substraten glutamine en glutamaat. De reactiemengsels werden afgeleid met ethylchloroformaat/ethanol en geanalyseerd door GC‐MS terwijl de glutamineanalyse negatief was, werd glutamaat omgezet in een product dat werd gedetecteerd als een nieuwe piek in het GC‐MS-chromatogram (figuur 1 C, 11,2 min). Controle-experimenten zonder enzym, glutamaat of 2-oxoglutaraat leverden het product niet op, waardoor werd bevestigd dat het enzym inderdaad 2‐oxoglutaraat‐afhankelijk is.

omdat de opbrengst met het gezuiverde enzym te laag was voor productisolatie, werd een hele‐celbenadering gebruikt: incubatie van levende E. coli GST‐iboH‐cellen met l‐glutamaat leverde voldoende hoeveelheden van het product op (ondersteunende informatie, figuur S1), dat door kationuitwisselingschromatografie als hydrochloride uit de cel supernatant werd geëxtraheerd. NMR analyse toonde de aanwezigheid van threo‐3‐hydroxyglutamaat aan, bevestigend de rol van IboH als l‐glutamaat 3‐(R)‐hydroxylase (figuren 1 D, S2, en S3).Dit is het eerste verslag van een enzymatische hydroxylering van vrije glutamaat.

om de biologische relevantie van glutamaathydroxylering in A. muscaria te bepalen, werden paddenstoelmonsters (verzameld in de buurt van Feldberg, Zwarte Woud, Duitsland) geanalyseerd met GC‐MS.Iboteenzuur werd gevonden samen met lage niveaus van 3‐hydroxyglutamaat (figuren S4 en S5). Dit wijst erop dat IboH actief is in zijn inheemse organisme, samenvalt met de productie van iboteenzuur. Voorts openbaarden de openbare RNA‐seq gegevens dat de zeven genen in ibo BGC hoogst worden uitgedrukt wanneer A. muscaria kunstmatig in symbiose met Populus werd gekweekt, die dicht bij zijn natuurlijke voorwaarde is (Figuur 2 A).12 om te onderzoeken of de genen functioneel verbonden zijn, werd de analyse van het coexpressienetwerk uitgevoerd. De gegevens toonden aan dat ibo genen een zeer gelijkaardig uitdrukkingspatroon hebben. Van een totaal van 11 915 tot expressie gebrachte genen, waren alle zeven ibo-genen nauw met elkaar geclusterd, wat wijst op een nauwe coregulatie en dus een gemeenschappelijke metabole functie (Figuur 2 B).13

afbeelding
Figuur 2

genomische en transcriptomische gegevens van de ibo BGC. A) genormaliseerde uitdrukking van IBO genen over RNA‐seq datasets van NCBI SRA: lage uitdrukking (blauw) aan hoge uitdrukking (rood). De zwarte lijn markeert cocultivatie-experimenten van Amanita muscaria met Populus tremula x tremuloides. Ter vergelijking wordt het β-tubulinegen meegeleverd. B) locatieonafhankelijke coexpressieclustering van 11 915 tot expressie gebrachte A. muscaria genen. De IBO genen cluster dicht bij elkaar, wat wijst op coregulatie. C) Co‐voorkomen van de ibo genen en (vermeende) iboteenzuur productie van Amanitasoorten met sequenced genomen/transcriptomen. De drie soorten die ibo genen bevatten behoren tot de Amanita sectie Amanita.

om de link van het ibo BGC met de productie van iboteenzuur verder te onderzoeken, werden transcriptomische gegevens van een andere iboteenzuurproducent, Amanita pantherina, gescreend op homologe genen.14, 15 de RNA-seq leest werden in kaart gebracht aan ibo BGC. A. pantherina brengt namelijk nauwe homologen van elk van de ibo-genen (>80% nucleotide-identiteit, figuur S6) actief tot expressie, waarmee het verband met de productie van iboteenzuur wordt bevestigd.

verder werd het transcriptoom van de verwante paddenstoelsoort Amanita crenulata gecontroleerd op IBO-homologen. Ook hier hadden alle genen overeenkomsten in A. crenulata (>80% nucleotide identiteit, figuur S7). Zo voorspellen we dat deze soort in staat is iboteenzuur en muscimol te produceren. Dit correleert met eerdere meldingen van menselijke intoxicatie met symptomen die lijken op die na blootstelling aan iboteenzuur en muscimol.16

daarnaast analyseerden we genomen van acht amanitasoorten uit vier taxonomische secties, die geen iboteenzuur produceren. Geen van deze bevatten de ibo BGC, wat de correlatie tussen iboteenzuur en de IBO genen onderbouwt (Figuur 2 C). Blijkbaar is de aanwezigheid van de IBO BGC beperkt tot Amanita sectie Amanita, die in overeenstemming is met eerdere studies over de taxonomische verdeling van de productie van iboteenzuur.17, 18

om de biosynthetische functies van de IBO-eiwitten af te leiden, werden hun sequenties vergeleken met bekende enzymen. Uit dit, stellen we de functies in Figuur 3 en beschreven in het volgende. De verwante proteã nen met bekende functies worden vermeld tussen haakjes samen met de identiteitswaarden van de aminozuuropeenvolging voor vergelijking.

 afbeelding
Figuur 3

voorgestelde alternatieve biosynthetische routes van iboteenzuur. Route A omvat n-hydroxylering van het amide van 7 door IboF. Route B omvat N-hydroxylering van een hypothetische externe verbinding die niet in de uiteindelijke structuur van iboteenzuur eindigt (1). Enzymen worden aangegeven door gekleurde cirkels: gevuld voor geverifieerde functie, niet gevuld voor afgeleide functie. PLP: pyridoxaal fosfaatafhankelijk enzym; FMO: flavineafhankelijk mono-oxygenase.

de eerste geëngageerde stap is glutamaathydroxylation door IboH, en de laatste stap is decarboxylation19 van ibotenic zuur aan muscimol door IboD (tryptofaandecarboxylase P0DPA6,20 32 %). De volgorde van de tussenreacties is enigszins dubbelzinnig. IboA (adenylatiedomein van F8P9P5,21 21 %) activeert waarschijnlijk het carboxylzuur op positie 5 om een amidebinding te introduceren, en de flavine mono−oxygenase IboF (heteroatoom oxygenases B8NM63, b8nm73,22 21-24 %) genereert de N-O binding. Er zijn verschillende opties voor de laatste stap. Een optie (Figuur 3 A) is dat IboF het door IboA gevormde amidestikstof direct hydroxyleert om een hydroxaminezuur-soort te produceren (cf. trichostatine biosynthese23). Een andere optie (Figuur 3 B) is dat IboF‐hydroxylaten een uitwendige n−bevattende verbinding, waarvan de resulterende N-O-binding vervolgens in de hydroxyglutamaatsteiger wordt ingebracht (cf. cycloserine biosynthese24).

de paralogeuze PLP‐afhankelijke enzymen IboG1 en IboG2 (cystathionine γ-synthase I1RZK8, 25 38-39 %) zijn waarschijnlijk betrokken bij de vervanging van de OH‐groep op positie 3 door de o-N-groep. Vergelijkbare substitutiereacties zijn bekend van andere PLP-afhankelijke enzymen, zoals cystathionine-β-synthase.Een alternatieve route die zonder IboG1/IboG2 zou kunnen doorgaan, wordt gegeven in de ondersteunende informatie (figuur S8).

het eerste cyclische tussenproduct is hoogstwaarschijnlijk tricholomisch zuur (6, figuur 1 A), dat waarschijnlijk door het cytochroom P450 IboC is gedesatureerd tot iboteenzuur (A1CFL5,A1CFL6,27 A0A286LF02, 20 27-30 %). Tricholomic acid (6) is een metaboliet geproduceerd door Tricholoma muscarium.Aangezien Tricholoma en Amanita verwant zijn (taxonomische orde Agaricales), moet de biosynthese van 6 vergelijkbaar zijn met die van iboteenzuur, waarbij de desaturatiestap wordt weggelaten. Verder zijn er iboteenzuur‐en tricholomic zuur-producerende schimmels voorgesteld, variërend van diverse taxa van Amantia-soorten tot Ustilago en Ophiocordyceps.17, 18, 29, 30 De hier gerapporteerde BGC biedt de mogelijkheid om de voorgestelde producenten op genetisch niveau opnieuw te beoordelen en zo de hypothese voor verdere producenten te verifiëren of te weerleggen.

samen geven onze bevindingen aan dat de ibo—genen verantwoordelijk zijn voor de productie van iboteenzuur in—ten minste-drie amanitasoorten. Het geïdentificeerde BGC bevat het glutamaathydroxylase IboH, waarvan de activiteit is aangetoond in een heteroloog systeem. Deze ontdekking herleeft het lang slapende onderzoek naar psychoactieve toxine biosynthese in de vliegenagarische. Volledige opheldering van de biosynthetische route zal de reacties onthullen die leiden tot de isoxazoolkern, en zal het gebruik voor biotechnologische toepassingen mogelijk maken.

Dankbetuigingen

Wij danken Katharina Strack en Sascha Ferlaino voor technische bijstand, PD Dr. Wolfgang Hüttel voor nuttige inzichten en opmerkingen, Dr. Jan-Patrick Steitz voor schimmelmateriaal, en Dr. Kay Greenfield voor het kritisch lezen van het manuscript. Het werk werd gefinancierd door de Duitse Onderzoeksstichting (Deutsche Forschungsgemeinschaft -235777276).

belangenconflict

de auteurs verklaren geen belangenconflict.

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.