IVF

Chasing Dreams

Biosynteza kwasu Ibotenowego w muchomorze jest inicjowana przez hydroksylację glutaminianu†

Amanita muscaria, muchomor, jest prawdopodobnie najbardziej znanym ze wszystkich grzybów, znany z ekstrawaganckiego wyglądu z czerwoną czapką pokrytą białymi plamkami i jego niesławną toksycznością. Podczas gdy grzyb jest w rzeczywistości mniej zabójczy niż ogólnie przypuszcza się, działanie psychoaktywne jest pośredniczone przez kwas ibotenowy (1) i jego produkt dekarboksylacji muscimol (2).1-3 posiadają strukturalne podobieństwo do neuroprzekaźników glutaminianu (3) i GABA (4), odpowiednio, aktywując odpowiednie receptory w mózgu (Fig.4, 5 ze względu na swoją aktywność, 1 i 2 zostały wykorzystane jako związki ołowiu do badań farmakologicznych; Pochodna kwasu ibotenowego AMPA, na przykład, nadała swoją nazwę najczęstszemu receptorowi glutaminianu w ludzkim mózgu.6

obrazek
Rysunek 1

odkrycie ibo BGC. A) struktury metabolitów i analogów Amanita muscaria. B) schemat IBO BGC. C) chromatogramy jonów całkowitych GC-MS w testach IboH: Tworzenie 3-hydroksyglutaminianu było zależne od 2-oksoglutaranu (2og), enzymu i glutaminianu. D) Stereoselektywna hydroksylacja glutaminianu przez IboH.

wkrótce po rozwiązaniu struktury kwasu ibotenowego w 1964 roku pojawiły się spekulacje dotyczące jego biosyntetycznego pochodzenia.1 opierając się na współistniejących metabolitach, Eugster i współpracownicy wysunęli hipotezę, że kwas ibotenowy pochodzi z 3‐hydroksyglutaminianu (5).7 jednak 3-hydroksyglutaminian nie został zidentyfikowany w muchomorze, a biosynteza kwasu ibotenowego i muscymolu pozostała niejasna.

aby zidentyfikować geny biosyntetyczne, założyliśmy, że tworzenie kwasu ibotenowego jest inicjowane hydroksylacją glutaminy lub glutaminianu. Do tej pory eksperymentalnie nie zweryfikowano żadnego enzymu katalizującego tę reakcję na wolnym substracie.8 niemniej jednak, 3-hydroksyglutamina (7, Fig. 3) występuje jako składnik nie-rybosomalnego peptydu pneumocandin B0 z Glarea lozoyensis. Jego biosyntetyczny klaster genów (BGC) zawiera przypuszczalną dioksygenazę GloE, która została zaproponowana jako enzym kandydujący do hydroksylacji glutaminy.9 dlatego użyliśmy sekwencji białka do przesiewania genomu A. muscaria.10 rzeczywiście, homologiczne białko, IboH (GenBank entry KIL56739), jest kodowane w regionie genetycznym, który zawiera sześć dodatkowych enzymów biosyntetycznych. 1 B) obejmuje enzym cytochromu P450 (IBOC KIL56737), monooksygenazę zależną od flawin (FMO, IBOF KIL56733), enzym adenylujący (IBOA KIL56732), dwa wzajemnie podobne enzymy zależne od fosforanu pirydoksalu (IboG1 KIL56738 i IboG2 KIL56740) i dekarboksylazę (IboD KIL56734). Geny zawierają wszystkie funkcjonalności potrzebne do biosyntezy kwasu ibotenowego (patrz poniżej).

Gen iboH ulegał ekspresji w Escherichia coli z N-końcowym znacznikiem GST (GenBank entry MN520442). Ponieważ przewiduje się, że IboH jest dioksygenazą zależną od FeII/2‐oksoglutaranu, oczyszczone białko inkubowano tlenowo z Fe2+, 2‐oksoglutaranem, kwasem askorbinowym i jednym z domniemanych substratów glutaminy i glutaminianu. Mieszaniny reakcyjne derivatizowano chloro mrówczanem etylu / etanolem i analizowano metodą GC-MS. podczas gdy test glutaminy był ujemny, glutaminian przekształcano do produktu, który wykryto jako nowy pik w chromatogramie GC-MS (Fig.1 C, 11,2 min). Eksperymenty kontrolne bez enzymu, glutaminianu lub 2‐oksoglutaranu nie przyniosły produktu, potwierdzając tym samym, że enzym jest rzeczywiście zależny od 2‐oksoglutaranu.

ponieważ wydajność oczyszczonego enzymu była zbyt niska do izolacji produktu, zastosowano podejście całokomórkowe: inkubacja żywych komórek GST‐iboh E. coli z l‐glutaminianem dała wystarczającą ilość produktu (Informacje uzupełniające, Fig. S1), który ekstrahowano z supernatantu komórkowego metodą chromatografii kationowymiennej jako chlorowodorek. Analiza NMR wykazała obecność Treo-3-hydroksyglutaminianu, potwierdzając rolę IboH jako L‐glutaminianu 3‐(R) – hydroksylazy (Fig. 1 D, S2 i S3).Jest to pierwszy raport o enzymatycznej hydroksylacji wolnego glutaminianu.

aby określić biologiczne znaczenie hydroksylacji glutaminianu w A. muscaria, próbki grzybów (zebrane w pobliżu Feldberg, Black Forest, Niemcy) analizowano za pomocą GC‐MS.wykryto kwas Ibotenowy wraz z niskim poziomem 3‐hydroksyglutaminianu (Fig. S4 i S5). Wskazuje to na to, że IboH jest aktywny w swoim rodzimym organizmie, zbiegając się z produkcją kwasu ibotenowego. Co więcej, publiczne dane RNA-seq ujawniły, że siedem genów w Ibo BGC jest silnie wyrażonych, gdy A. muscaria była sztucznie hodowana w symbiozie z Populus, która jest zbliżona do jej naturalnego stanu (ryc. 2 A).12 w celu zbadania, czy geny są funkcjonalnie powiązane, przeprowadzono analizę sieci koekspresji. Dane wykazały, że geny ibo mają bardzo podobny wzór ekspresji. W sumie 11 915 genów ulegających ekspresji, wszystkie siedem genów ibo skupiło się blisko siebie, co wskazuje na ścisłą koregulację, a tym samym wspólną funkcję metaboliczną (ryc. 2 B).13

obrazek
Rysunek 2

dane genomowe i transkryptomiczne IBO BGC. A) znormalizowana ekspresja genów ibo w zestawach danych RNA-seq z NCBI SRA: niska ekspresja (niebieski) do wysokiej ekspresji (czerwony). Czarna linia oznacza eksperymenty kokultywacyjne Amanita muscaria z Populus tremula x tremuloides. Do porównania dołączono Gen β‐tubuliny. B) niezależne od lokalizacji grupowanie koekspresji 11 915 ekspresji genów A. muscaria. Geny ibo skupiają się blisko siebie, co wskazuje na koregulację. C) współwystępowanie genów ibo i (przypuszczalne) produkcji kwasu ibotenowego gatunków Amanita z sekwencjonowanymi genomami / transkryptomami. Trzy gatunki zawierające geny ibo należą do sekcji Amanita.

w celu dalszego badania związku IBO BGC z produkcją kwasu ibotenowego, dane transkryptomiczne innego producenta kwasu ibotenowego, Amanita pantherina, zbadano pod kątem genów homologicznych.14, 15 odczyty RNA‐seq zostały zmapowane do IBO BGC. Rzeczywiście, A. pantherina aktywnie wyraża bliskie homologi każdego z genów ibo (>80% tożsamości nukleotydowej, rysunek S6), potwierdzając związek z produkcją kwasu ibotenowego.

ponadto transkryptom pokrewnego gatunku grzybów Amanita crenulata został sprawdzony pod kątem homologów ibo. Ponownie, wszystkie geny wykazywały zgodność w A. crenulata (>80% tożsamości nukleotydów, rysunek S7). Tak więc przewidujemy, że gatunek ten jest zdolny do produkcji kwasu ibotenowego i muscymolu. Koreluje to z wcześniejszymi doniesieniami o zatruciu u ludzi z objawami przypominającymi objawy po ekspozycji na kwas ibotenowy i muscymol.16

dodatkowo przeanalizowaliśmy genomy ośmiu gatunków Amanita z czterech sekcji taksonomicznych, które nie wytwarzają kwasu ibotenowego. Żaden z nich nie zawiera IBO BGC, co potwierdza korelację pomiędzy kwasem ibotenowym a genami ibo (fig. 2 C). Najwyraźniej obecność IBO BGC ogranicza się do sekcji Amanita, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami nad taksonomicznym rozkładem produkcji kwasu ibotenowego.17, 18

aby wydedukować biosyntetyczne funkcje białek ibo, ich sekwencje dopasowano do znanych enzymów. Na tej podstawie proponujemy funkcje zilustrowane na rysunku 3 i opisane poniżej. Powiązane białka o znanych funkcjach są wymienione w nawiasach wraz z wartościami identyczności sekwencji aminokwasów dla porównania.

obrazek
Rysunek 3

proponowane alternatywne szlaki biosyntetyczne kwasu ibotenowego. Szlak A obejmuje N-hydroksylację amidu 7 przez IboF. Szlak B obejmuje N-hydroksylację hipotetycznego związku zewnętrznego, który nie kończy się w końcowej strukturze kwasu ibotenowego (1). Enzymy są oznaczone kolorowymi kółkami: wypełnionymi dla funkcji zweryfikowanej, niewypełnionymi dla funkcji wnioskowanej. PLP: enzym zależny od fosforanu pirydoksalu; FMO: monooksygenaza zależna od flawiny.

pierwszym zaangażowanym etapem jest hydroksylacja glutaminianu przez IboH, a ostatnim etapem jest dekarboksylacja19 kwasu ibotenowego do muscymolu przez IboD (dekarboksylaza tryptofanowa P0DPA6,20 32 %). Kolejność reakcji pośrednich jest niejednoznaczna. Iboa (domena adenylacji f8p9p5,21 21 %) prawdopodobnie aktywuje kwas karboksylowy w pozycji 5, wprowadzając wiązanie amidowe, a monooksygenaza flawiny ibof (oksygenazy heteroatomu B8NM63,B8NM73, 22 21-24 %) wytwarza Wiązanie N−O. Istnieje kilka opcji dla tego ostatniego kroku. Jedną z opcji (Fig. 3 A) jest to, że IboF bezpośrednio hydroksyluje amidowy azot utworzony przez IboA w celu wytworzenia kwasu hydroksamowego (por. biosynteza trichostatyny 23). Inną opcją (Fig. 3 B) jest to, że ibof hydroksyluje zewnętrzny związek zawierający N, którego powstałe Wiązanie N‐O jest następnie wprowadzane do rusztowania hydroksyglutaminianu (por. cycloserine biosynthesis24).

paralogiczne enzymy zależne od PLP IboG1 i IboG2 (syntaza γ-cystationiny i1rzk8, 25 38-39%) prawdopodobnie biorą udział w podstawieniu grupy OH w pozycji 3 przez ugrupowanie O – n. Podobne reakcje substytucji są znane z innych enzymów zależnych od PLP, takich jak syntaza β‐cystationiny.Alternatywną drogę, która mogłaby przebiegać bez IboG1 / IboG2 podano w informacji uzupełniających (rysunek S8).

pierwszym cyklicznym produktem pośrednim jest najprawdopodobniej kwas tricholomowy (6, Fig. 1 A), który prawdopodobnie ulega desaturacji do kwasu ibotenowego przez IboC cytochromu P450 (a1cfl5,A1cfl6,27 A0A286LF02, 20 27-30%). Kwas tricholomowy (6) jest metabolitem wytwarzanym przez Tricholoma muscarium.28 ponieważ Tricholoma i Amanita są spokrewnione (rząd taksonomiczny Agaricales), biosynteza 6 powinna być podobna do biosyntezy kwasu ibotenowego, pomijając etap desaturacji. Zaproponowano dalsze grzyby wytwarzające kwas ibotenowy i tricholomowy, obejmujące różne taksony od gatunków Amantia po Ustilago i Ophiocordyceps.17, 18, 29, 30 raport BGC daje możliwość ponownej oceny proponowanych producentów na poziomie genetycznym, a tym samym weryfikacji lub obalenia hipotezy dla dalszych producentów.

łącznie nasze wyniki wskazują, że geny ibo są odpowiedzialne za produkcję kwasu ibotenowego u co najmniej trzech gatunków Amanity. Zidentyfikowane BGC zawiera hydroksylazę glutaminianową IboH, której aktywność wykazano w układzie heterologicznym. Odkrycie to ożywia długo uśpione badania nad biosyntezą toksyn psychoaktywnych w muchomorze. Pełne wyjaśnienie szlaku biosyntetycznego ujawni reakcje, które prowadzą do rdzenia izoksazolowego i umożliwi wykorzystanie do zastosowań biotechnologicznych.

podziękowania

Dziękujemy Katharinie Strack i Saschy Ferlaino za pomoc techniczną, PD dr Wolfgang Hüttel za pomocne spostrzeżenia i komentarze, Dr. Jan-Patrick Steitz za materiał grzybowy i dr Kay Greenfield za krytyczną lekturę rękopisu. Praca została sfinansowana przez niemiecką Fundację badawczą (Deutsche Forschungsgemeinschaft -235777276).

konflikt interesów

autorzy nie deklarują konfliktu interesów.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.