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Ibotenic Biossíntese de Ácido na Mosca Enlatado É Iniciada pelo Glutamato Hidroxilação†

Amanita muscaria, a mosca enlatado, é talvez o mais proeminente de todos os cogumelos, conhecidos por sua aparência extravagante, com um boné vermelho coberto por manchas brancas, e seu infame toxicidade. Embora o cogumelo seja menos mortal do que geralmente se supõe, os efeitos psicoativos são mediados pelo ácido ibotênico (1) e seu produto de descarboxilação muscimol (2).1-3 Eles possuem semelhança estrutural com os neurotransmissores glutamato (3) e GABA (4), respectivamente, ativando os receptores correspondentes no cérebro (Figura 1 A).4, 5 devido à sua atividade, 1 e 2 têm sido usados como compostos de chumbo para pesquisa farmacológica; o derivado do ácido ibotênico AMPA, por exemplo, deu seu nome ao receptor de glutamato mais comum no cérebro humano.6

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Figura 1

a Descoberta do ibo BGC. A) estruturas de metabólitos e análogos de Amanita muscaria. B) esquema do Ibo BGC. C) cromatogramas de íons totais GC‐MS de ensaios de IboH: a formação de 3‐hidroxiglutamato foi dependente de 2‐oxoglutarato (2OG), enzima e glutamato. D) hidroxilação estereosseletiva do glutamato por IboH.

pouco depois que a estrutura do ácido ibotênico foi resolvida em 1964, houve especulações sobre sua origem biossintética.1 com base em metabólitos concomitantes, Eugster e colegas de trabalho levantaram a hipótese de que o ácido ibotênico é derivado do 3‐hidroxiglutamato (5).7 No entanto, o 3-hidroxiglutamato não foi identificado no agaric de mosca e a biossíntese de ácido ibotênico e muscimol permaneceu obscura.

para identificar os genes biossintéticos, assumimos que a formação de ácido ibotênico é iniciada com a hidroxilação de glutamina ou glutamato. Até agora, nenhuma enzima que catalisa essa reação no substrato livre foi verificada experimentalmente.8 No entanto, a 3‐hidroxiglutamina (7, Figura 3) ocorre como um componente do peptídeo não ribossômico pneumocandina B0 de Glarea lozoyensis. Seu cluster de genes biossintéticos (BGC) inclui uma suposta dioxigenase, GloE, que foi proposta como uma enzima candidata para a hidroxilação da glutamina.9 Portanto, usamos sua sequência de proteínas para rastrear o genoma de A. muscaria.10 de fato, uma proteína homóloga, IboH (GenBank entry KIL56739), é codificada em uma região genética que apresenta seis enzimas biossintéticas adicionais. Este putativo ibo BGC (Figura 1 B) compreende uma enzima citocromo P450 (IboC KIL56737), um flavin‐dependente monooxygenase (FMO, IboF KIL56733), um adenylating enzima (IboA KIL56732), dois mutuamente semelhantes o piridoxal fosfato (PLP)‐dependente de enzimas (IboG1 KIL56738 e IboG2 KIL56740), e uma descarboxilase (IboD KIL56734). Os genes incluem todas as funcionalidades putativamente necessárias para a biossíntese do ácido ibotênico (veja abaixo).

consequentemente, a atribuição do BGC foi verificada experimentalmente. O gene iboH foi expresso em Escherichia coli com um tag GST N‐terminal (GenBank entry MN520442). Como se prevê que o IboH seja uma dioxigenase dependente de FeII / 2-oxoglutarato, a proteína purificada foi incubada aerobicamente com Fe2+, 2‐oxoglutarato, ácido ascórbico e um dos substratos putativos glutamina e glutamato. As misturas de reação foram derivatizadas com cloroformato de etila / etanol e analisadas por GC-MS. enquanto o ensaio de glutamina foi negativo, o glutamato foi transformado em um produto que foi detectado como um novo pico no cromatograma GC‐MS (Figura 1 C, 11,2 min). Experimentos de controle sem enzima, glutamato ou 2‐oxoglutarato não produziram o produto, confirmando assim que a enzima é de fato dependente de 2‐oxoglutarato.

como o rendimento com a enzima purificada era muito baixo para o isolamento do Produto, foi utilizada uma abordagem de células inteiras: a incubação de células vivas de E. coli GST‐iboH com L‐glutamato deu quantidades suficientes do Produto (Informações de suporte, Figura S1), que foi extraído do sobrenadante celular por cromatografia de troca catiônica como o cloridrato. A análise de RMN mostrou a presença de Treo-3-hidroxiglutamato, confirmando o papel do IboH como sendo um L‐glutamato 3‐(R)‐hidroxilase (Figuras 1 D, S2 e S3).11 Este é o primeiro relato de uma hidroxilação enzimática do glutamato livre.

Para determinar a relevância biológica de glutamato hidroxilação em A. muscaria, cogumelo amostras coletadas perto de Feldberg, Floresta Negra, Alemanha) foram analisadas por GC‐MS. Ibotenic ácido foi detectado, juntamente com baixos níveis de 3‐hydroxyglutamate (Figuras S4 e S5). Isso sugere que IboH seja ativo em seu organismo nativo, coincidindo com a produção de ácido ibotênico. Além disso, dados públicos de RNA-seq revelaram que os sete genes no IBO BGC são altamente expressos quando A. muscaria foi cultivada artificialmente em simbiose com Populus, o que está próximo de sua condição natural (Figura 2 a).Para investigar se os genes estão funcionalmente ligados, foi realizada análise de rede de coexpressão. Os dados mostraram que os genes ibo têm um padrão de expressão muito semelhante. De um total de 11 915 genes expressos, todos os sete genes ibo se agruparam intimamente, indicando coregulação apertada e, portanto, uma função metabólica comum (Figura 2 B).13

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Figura 2

Genômica e transcriptomic dados do ibo BGC. A) expressão normalizada de genes ibo em conjuntos de dados RNA-seq de NCBI SRA: baixa expressão (azul) a alta expressão (vermelho). A linha preta marca experimentos de cocultivação de Amanita muscaria com Populus tremula x tremuloides. O gene β-tubulina está incluído para comparação. B) agrupamento de Coexpressão independente de localização de 11 915 genes A. muscaria expressos. Os genes Ibo se agrupam intimamente, indicando coregulação. C) co-ocorrência dos genes ibo e (putativo) produção de ácido ibotênico de espécies de Amanita com genomas/transcriptomas sequenciados. As três espécies que contêm genes ibo pertencem à seção Amanita Amanita.

para investigar ainda mais a ligação do Ibo BGC à produção de ácido ibotênico, os dados transcriptômicos de outro produtor de ácido ibotênico, Amanita pantherina, foram selecionados para genes homólogos.14, 15 as leituras de RNA-seq foram mapeadas para o IBO BGC. De fato, A. pantherina expressa ativamente homólogos próximos de cada um dos genes ibo (>80% de identidade nucleotídica, figura S6), confirmando a ligação à produção de ácido ibotênico.

além disso, o transcriptoma da espécie de cogumelo relacionada Amanita crenulata foi verificado para homólogos ibo. Novamente, todos os genes expressaram correspondências em A. crenulata (>80% de identidade nucleotídica, figura S7). Assim, prevemos que esta espécie é capaz de produzir ácido ibotênico e muscimol. Isso se correlaciona com relatos anteriores de intoxicação humana com sintomas que se assemelham aos após a exposição ao ácido ibotênico e ao muscimol.Além disso, analisamos genomas de oito espécies de Amanita de quatro seções taxonômicas, que não produzem ácido ibotênico. Nenhum deles contém o IBO BGC, comprovando a correlação entre o ácido ibotênico e os genes ibo (Figura 2 C). Aparentemente, a presença do Ibo BGC está confinada à seção Amanita Amanita, que está de acordo com estudos anteriores sobre a distribuição taxonômica da produção de ácido ibotênico.17, 18

para deduzir as funções biossintéticas das proteínas ibo, suas sequências foram combinadas contra enzimas conhecidas. A partir disso, propomos as funções ilustradas na Figura 3 e descritas a seguir. Proteínas relacionadas com funções conhecidas são listadas entre parênteses, juntamente com valores de identidade de sequência de aminoácidos para comparação.

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Figura 3

vias biossintéticas alternativas propostas do ácido ibotênico. A via a envolve n-hidroxilação da Amida de 7 por IboF. A via B envolve a n-hidroxilação de um composto externo hipotético que não acaba na estrutura final do ácido ibotênico (1). As enzimas são indicadas por círculos coloridos: preenchido para função verificada, não preenchido para função inferida. PLP: enzima dependente de fosfato piridoxal; FMO: monooxigenase dependente de flavina.

a primeira etapa comprometida é a hidroxilação do glutamato por IboH,e a última etapa é a descarboxilação19 do ácido ibotênico ao muscimol por IboD (triptofano descarboxilase P0DPA6, 20 32 %). A ordem das reações intermediárias é um tanto ambígua. IboA (adenylation domínio de F8P9P5,21 de 21 %), provavelmente activa o ácido carboxílico na posição 5 para introduzir uma amida, e o flavin monooxygenase IboF (heteroatom oxygenases B8NM63, B8NM73,22 21-24 %) gera Nenhuma obrigação. Existem várias opções para a última etapa. Uma opção (Figura 3 A) é que IboF hidroxila diretamente o nitrogênio amida formado pelo IboA para produzir uma espécie de ácido hidroxâmico (cf. trichostatin biosynthesis23). Outra opção (Figura 3 B) é que IboF hidroxila um composto externo contendo n, cuja ligação n−O resultante é subsequentemente introduzida no andaime de hidroxiglutamato (cf. biossíntese de cicloserina24).

as enzimas paralógicas dependentes de PLP IboG1 e IboG2 (cistationina γ‐sintase I1RZK8,25 38-39 %) provavelmente estão envolvidas na substituição do grupo OH na posição 3 pela porção o‐n. Reações de substituição semelhantes são conhecidas de outras enzimas dependentes de PLP, como cistationina β‐sintase.26 uma via alternativa que poderia prosseguir sem IboG1/IboG2 é dada nas informações de suporte (Figura S8).

o primeiro intermediário cíclico é provavelmente o ácido tricolômico (6, Figura 1 A), que é provavelmente desaturado ao ácido ibotênico pelo citocromo P450 IboC (A1CFL5,a1cfl6,27 a0a286lf02, 20 27-30 %). O ácido tricolômico (6) é um metabólito produzido pelo Tricholoma muscarium.28 Como Tricoloma e Amanita estão relacionados (ordem taxonômica Agaricales), a biossíntese de 6 deve ser semelhante à do ácido ibotênico, omitindo a etapa de dessaturação. Outros fungos produtores de ácido ibotênico e ácido tricolômico foram propostos, variando diversos taxa de espécies de Amantia a Ustilago e Ophiocordyceps.17, 18, 29, 30 o BGC aqui relatado oferece a oportunidade de reavaliar os produtores propostos no nível genético e, assim, verificar ou refutar a hipótese para outros produtores.

juntos, nossos achados indicam que os genes ibo são responsáveis pela produção de ácido ibotênico em—pelo menos—três espécies de Amanita. O BGC identificado contém o glutamato hidroxilase IboH, cuja atividade foi demonstrada em um sistema heterólogo. Esta descoberta revive a pesquisa há muito adormecida sobre a biossíntese de toxinas psicoativas no agaric da mosca. A elucidação completa da via biossintética revelará as reações que levam ao núcleo do isoxazol e permitirá a utilização para aplicações biotecnológicas.

Agradecimentos

agradecemos a Katharina Strack e Sascha Ferlaino para assistência técnica, PD Dr. Wolfgang Hüttel útil insights e comentários, Dr. Jan-Patrick Steitz para material fúngico, e Dr. Kay Greenfield para ler criticamente o manuscrito. O trabalho foi financiado pela Fundação Alemã de pesquisa (Deutsche Forschungsgemeinschaft -235777276).

conflito de interesses

os autores declaram não haver conflito de interesses.

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