IVF

Chasing Dreams

biosinteza acidului Ibotenic în agaric de muscă este inițiată prin hidroxilarea glutamatului

Amanita muscaria, agaricul de muscă, este probabil cea mai proeminentă dintre toate ciupercile, cunoscută pentru aspectul său extravagant, cu un capac roșu acoperit de pete albe și toxicitatea sa infamă. În timp ce ciuperca este de fapt mai puțin mortală decât se presupune în general, efectele psihoactive sunt mediate de acidul ibotenic (1) și de produsul său de decarboxilare muscimol (2).1-3 au similitudine structurală cu neurotransmițătorii glutamat (3) și GABA (4), respectiv, activând receptorii corespunzători din creier (Figura 1 A).4, 5 datorită activității lor, 1 și 2 au fost utilizate ca compuși de plumb pentru cercetarea farmacologică; derivatul acidului ibotenic AMPA, de exemplu, și-a dat numele celui mai comun receptor de glutamat din creierul uman.6

imagine
Figura 1

descoperirea ibo BGC. A) structuri ale metaboliților și analogilor Amanita muscaria. B) schema ibo BGC. C) cromatogramele ionice totale GC‐MS ale testelor IboH: formarea 3‐hidroxiglutamatului a fost dependentă de 2-oxoglutarat (2OG), enzimă și glutamat. D) hidroxilarea stereoselectivă a glutamatului de către IboH.

la scurt timp după ce structura acidului ibotenic a fost rezolvată în 1964, au existat speculații cu privire la originea sa biosintetică.1 pe baza metaboliților comuni, Eugster și colegii săi au emis ipoteza că acidul ibotenic este derivat din 3-hidroxiglutamat (5).7 Cu toate acestea, 3‐hidroxiglutamatul nu a fost identificat în agaricul de muște, iar biosinteza acidului ibotenic și a muscimolului a rămas obscură.

pentru a identifica genele biosintetice, am presupus că formarea acidului ibotenic este inițiată cu hidroxilarea fie a glutaminei, fie a glutamatului. Până în prezent, nicio enzimă care catalizează această reacție pe substratul liber nu a fost verificată experimental.8 Cu toate acestea, 3‐hidroxiglutamina (7, Figura 3) apare ca o componentă a peptidei non‐ribozomale pneumocandina B0 din Glarea lozoyensis. Grupul său de gene biosintetice (BGC) include o dioxigenază presupusă, GloE, care a fost propusă ca enzimă candidată pentru hidroxilarea glutaminei.9 prin urmare, am folosit secvența sa de proteine pentru a examina genomul A. muscaria.10 într-adevăr, o proteină omoloagă, IboH (GenBank entry KIL56739), este codificată într-o regiune genetică care conține șase enzime biosintetice suplimentare. Acest ibo BGC presupus (Figura 1 B) cuprinde o enzimă citocrom P450 (IboC KIL56737), o monooxigenază dependentă de flavină (FMO, IboF KIL56733), o enzimă adenilantă (IboA KIL56732), două enzime dependente de piridoxal fosfat (PLP) similare reciproc (IboG1 KIL56738 și IboG2 KIL56740) și o decarboxilază (IboD kil56734). Genele includ toate funcționalitățile necesare pentru biosinteza acidului ibotenic (vezi mai jos).

în consecință, atribuirea BGC a fost verificată experimental. Gena iboH a fost exprimată în Escherichia coli cu o etichetă GST N-terminală (intrare GenBank MN520442). Deoarece se preconizează că IboH este o dioxigenază dependentă de FeII/2‐oxoglutarat, proteina purificată a fost incubată aerob cu Fe2+, 2‐oxoglutarat, acid ascorbic și unul dintre substraturile presupuse glutamină și glutamat. Amestecurile de reacție au fost derivate cu cloroformat de etil/etanol și analizate prin GC-MS. în timp ce testul glutaminei a fost negativ, glutamatul a fost transformat într‐un produs care a fost detectat ca un nou vârf în cromatograma GC-MS (Figura 1 C, 11,2 min). Experimentele de Control lipsite de enzimă, glutamat sau 2-oxoglutarat nu au produs produsul, confirmând astfel că enzima este într‐adevăr dependentă de 2‐oxoglutarat.

deoarece randamentul cu enzima purificată a fost prea scăzut pentru izolarea produsului, s‐a utilizat o abordare cu celule întregi: incubarea celulelor vii E. coli GST‐iboH cu L‐glutamat a dat cantități suficiente de produs (informații justificative, figura S1), care a fost extras din supernatantul celular prin cromatografie cu schimb de cationi sub formă de clorhidrat. Analiza RMN a arătat prezența Treo‐3‐hidroxiglutamatului, confirmând rolul IboH ca fiind un L‐glutamat 3 – (R) – hidroxilază (Figurile 1 D, S2 și S3).11 Acesta este primul raport al unei hidroxilări enzimatice a glutamatului liber.

pentru a determina relevanța biologică a hidroxilării glutamatului în A. muscaria, probele de ciuperci (colectate lângă Feldberg, Pădurea Neagră, Germania) au fost analizate de GC‐MS.acidul Ibotenic a fost detectat împreună cu niveluri scăzute de 3‐hidroxiglutamat (figurile S4 și S5). Acest lucru indică faptul că IboH este activ în organismul său nativ, coincizând cu producția de acid ibotenic. Mai mult, datele publice ARN-seq au arătat că cele șapte gene din ibo BGC sunt foarte exprimate atunci când A. muscaria a fost cultivată artificial în simbioză cu Populus, care este aproape de starea sa naturală (Figura 2 A).12 pentru a investiga dacă genele sunt legate funcțional, a fost efectuată analiza rețelei de coexpresie. Datele au arătat că genele ibo au un model de Expresie foarte similar. Dintr-un total de 11 915 gene exprimate, toate cele șapte gene ibo s-au grupat strâns, indicând o coreglare strânsă și, prin urmare, o funcție metabolică comună (Figura 2 B).13

imagine
Figura 2

date genomice și transcriptomice ale ibo BGC. A) expresia normalizată a genelor ibo în seturile de date ARN‐seq de la NCBI SRA: Expresie scăzută (albastru) la Expresie ridicată (roșu). Linia neagră marchează experimentele de cocultivare ale Amanita muscaria cu Populus tremula x tremuloides. Pentru comparație, este inclusă gena de tubulină a numărului de celule‐tubulină. B) gruparea de coexpresie independentă de locație a 11 915 gene A. muscaria exprimate. Genele ibo se grupează strâns împreună, indicând coreglarea. C) Co‐apariția genelor ibo și producția (presupusă) de acid ibotenic a speciilor Amanita cu genomi/transcriptomi secvențiați. Cele trei specii care conțin gene ibo aparțin secțiunii Amanita Amanita.

pentru a cerceta în continuare legătura ibo BGC cu producția de acid ibotenic, datele transcriptomice ale unui alt producător de acid ibotenic, Amanita pantherina, au fost examinate pentru gene omoloage.14, 15 citirile ARN‐seq au fost mapate la ibo BGC. Într-adevăr, A. pantherina exprimă în mod activ omologi apropiați ai fiecăreia dintre genele ibo (>80% identitate nucleotidică, figura S6), confirmând legătura cu producția de acid ibotenic.

în plus, transcriptomul speciilor de ciuperci înrudite Amanita crenulata a fost verificat pentru omologi ibo. Din nou, toate genele au exprimat potriviri în A. crenulata (>80% identitate nucleotidică, figura S7). Astfel, prezicem că această specie este capabilă să producă acid ibotenic și muscimol. Acest lucru se corelează cu rapoartele anterioare de intoxicație umană cu simptome care seamănă cu cele după expunerea la acid ibotenic și muscimol.16

în plus, am analizat genomii a opt specii Amanita din patru secțiuni taxonomice, care nu produc acid ibotenic. Niciuna dintre acestea nu conține ibo BGC, fundamentând corelația dintre acidul ibotenic și genele ibo (Figura 2 C). Aparent, prezența ibo BGC este limitată la secțiunea Amanita Amanita, care este în conformitate cu studiile anterioare privind distribuția taxonomică a producției de acid ibotenic.17, 18

pentru a deduce funcțiile biosintetice ale proteinelor ibo, secvențele lor au fost potrivite cu enzimele cunoscute. Din aceasta, propunem funcțiile ilustrate în Figura 3 și descrise în cele ce urmează. Proteinele înrudite cu funcții cunoscute sunt enumerate între paranteze împreună cu valorile identității secvenței de aminoacizi pentru comparație.

imagine
Figura 3

propuse căi alternative biosintetice ale acidului ibotenic. Calea A implică n-hidroxilarea amidei lui 7 de către IboF. Calea B implică n-hidroxilarea unui compus extern ipotetic care nu ajunge în structura finală a acidului ibotenic (1). Enzimele sunt indicate prin cercuri colorate: umplute pentru funcția verificată, neumplute pentru funcția dedusă. PLP: enzimă dependentă de piridoxal fosfat; FMO: monooxigenază dependentă de flavin.

primul pas angajat este hidroxilarea glutamatului de către IboH,iar ultimul pas este decarboxilarea19 a acidului ibotenic la muscimol de către IboD (triptofan decarboxilază P0DPA6, 20 32 %). Ordinea reacțiilor intermediare este oarecum ambiguă. IboA (domeniul de adenilare al F8P9P5,21 21 %) activează probabil acidul carboxilic în poziția 5 pentru a introduce o legătură amidică, iar flavin Monooxigenaza IboF (heteroatom oxigenaze B8NM63, B8NM73,22 21-24 %) generează legătura N−O. Există mai multe opțiuni pentru ultimul pas. O opțiune (Figura 3 A) este aceea că IboF hidroxilează direct azotul amidic format de IboA pentru a produce o specie de acid hidroxamic (cf. biosinteza trichostatinei 23). O altă opțiune (Figura 3 B) este aceea că IboF hidroxilează un compus extern care conține N, A cărui legătură N‐o rezultată este introdusă ulterior în Schela hidroxiglutamat (cf. biosinteza cicloserinei 24).

enzimele paraloge dependente de PLP,IboG1 și IboG2 (cistationină‐sintază i1rzk8, 25 38-39 %) sunt probabil implicate în substituția grupului OH în poziția 3 cu partea O‐N. Reacții de substituție similare sunt cunoscute și de la alte enzime dependente de PLP, cum ar fi cistationina‐sintaza‐xixt.26 o cale alternativă care ar putea continua fără IboG1/IboG2 este prezentată în informațiile justificative (figura S8).

primul intermediar ciclic este cel mai probabil acidul tricholomic (6, Figura 1 A), care este probabil desaturat la acid ibotenic de citocromul P450 IboC (A1cfl5, a1cfl6,27 a0a286lf02,20 27-30 %). Acidul Tricholomic (6) este un metabolit produs de Tricholoma muscarium.28 deoarece Tricholoma și Amanita sunt înrudite (ordinul taxonomic Agaricales), biosinteza lui 6 ar trebui să fie similară cu cea a acidului ibotenic, omițând etapa de desaturare. Au fost propuse și alte ciuperci producătoare de acid ibotenic și acid tricholomic, variind de la diverse taxoni amantia specii la Ustilago și Ophiocordyceps.17, 18, 29, 30 BGC raportat aici oferă posibilitatea de a reevalua producătorii propuși la nivel genetic și, astfel, de a verifica sau de a respinge ipoteza pentru alți producători.

luate împreună, descoperirile noastre indică faptul că genele ibo sunt responsabile pentru producerea acidului ibotenic în—cel puțin—trei specii Amanita. BGC identificat conține glutamat hidroxilază IboH, a cărei activitate a fost demonstrată într-un sistem heterolog. Această descoperire reînvie cercetările de lungă durată privind biosinteza toxinei psihoactive în agaricul zburător. Elucidarea completă a căii biosintetice va dezvălui reacțiile care duc la miezul izoxazolului și va permite utilizarea pentru aplicații biotehnologice.

mulțumiri

îi mulțumim lui Katharina Strack și Sascha Ferlaino pentru asistență tehnică, PD Dr. Wolfgang h Inkttel pentru informații și comentarii utile, Dr. Jan-Patrick Steitz pentru materialul fungic și Dr.Kay Greenfield pentru citirea critică a manuscrisului. Lucrarea a fost finanțată de Fundația Germană de cercetare (Deutsche Forschungsgemeinschaft -235777276).

Conflict de interese

autorii nu declară niciun conflict de interese.

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.